表没食子儿茶素没食子酸酯联合视黄酸对宫颈腺癌细胞的抗增殖作用研究

李　杰

(莱芜市妇幼保健院 妇科,山东 莱芜271100)

表没食子儿茶素没食子酸酯联合视黄酸对宫颈腺癌细胞的抗增殖作用研究

李杰

(莱芜市妇幼保健院 妇科,山东 莱芜271100)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0547)

流行病学调查表明，茶及其组分对人体的健康具有潜在益处。绿茶含有特殊的茶多酚物质，茶多酚作为绿茶中主要的有效活性成分占绿茶干重的30%-42%。其中儿茶素是生物活性最高的成分。儿茶素是以儿茶和没食子酸基团结合形成的一类活性物质，其中表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是儿茶素中含量最高也是活性最高的成分[1]。报道资料显示，EGCG主要有抑菌作用、抗炎作用、抗氧化作用和抗心血管疾病作用等药理作用，同时EGCG能明显抑制许多类型癌细胞的生长，因此，EGCG的抗癌潜能已成为国内外研究的热点之一[2]。

视黄酸(retinoic acid,RA)是一组自然或人工合成的维生素A类似物，在调节生长、分化和形态发生等方面起重要作用。大量的体外研究证实，RA能逆转癌前病变、抑制继发瘤形成以及抑制癌细胞生长[3]。因此，基于已知研究基础和理论，本研究探讨EGCG 联合RA对HPV18呈阳性表达的宫颈腺癌HeLa细胞增殖的影响，以期为EGCG和RA的应用提供基础资料。

1材料与方法

1.1　主要材料

胎牛血清和高糖DMEM培养基购自Gibco公司；胰蛋白酶、谷氨酰胺、青霉素、硫酸链霉素、EGCG、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)和四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)购自美国Sigma公司；宫颈腺癌HeLa细胞购自美国模式菌种收集中心(American type culture collection,ATCC)，实验常规冻存。

1.2　方法

1.2.1细胞培养HeLa细胞培养于含10%灭活胎牛血清，2 mM谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 U/mL硫酸链霉素的高糖DMEM(D-10培养基)细胞培养液中，置于37℃，5% CO2细胞培养箱，2-3天换液。细胞传代时，弃去培养基，预热PBS洗两次，0.25%胰蛋白酶消化，显微镜下观察细胞变圆时弃去胰蛋白酶，加入含10%灭活胎牛血清的培养液轻轻吹散细胞团，然后分装入细胞培养瓶中并加入适量培养液继续培养，待培养瓶内细胞生长至80%后用于后续实验。

1.2.2细胞增殖抑制检测将1×105的HeLa细胞接种于96孔细胞培养板中培养24 h，实验组(添加终浓度5、10、20、40、80 μmol/L的EGCG或同时含有终浓度0.1 μmol/L的RA)，同时设对照组，每组重复3孔。分别于2、4、8、16、32 h后，加MTT液(5 mg/mL)20 μL /孔，继续培养4 h，吸弃上清液，加入150 μL /孔DMSO振荡混匀10 min，使蓝紫色沉淀充分溶解，选择490 nm波长，在全自动酶标仪上测定吸光度A值，实验重复3次。按下列公式计算平均细胞生长抑制率：细胞生长抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。

1.2.3细胞毒性检测将1×105的HeLa细胞接种于96孔板中培养24 h，实验组(添加终浓度5、10、20、40、80 μmol/L的EGCG或同时含有终浓度0.1 μmol/L的RA)，同时设对照组，每组重复3孔。37℃，5% CO2培养箱培养12 h。将96孔培养板1 000 rpm 离心5 min，分别从各孔中取120 μL的上清液加入到新的96孔培养板中。分别向每个孔中加入60 μL含20 μL乳酸溶液，20 μL 1×INT溶液和20 μL酶溶液的LDH检测工作液，混匀后包上铝箔，室温置于摇床上轻轻震荡孵育30 min。选择490 nm波长，在全自动酶标仪上测定吸光度A值。

1.2.4细胞凋亡和细胞周期分析将1×105的HeLa细胞接种于96孔板中培养24 h，实验组(添加终浓度5、10、20、40、80 μmol/L的EGCG或同时含有终浓度0.1 μmol/L的RA)，同时设对照组，每组重复3孔。37℃，5% CO2培养箱培养12 h。显微镜下观察细胞形态变化。收集细胞并加入70%乙醇溶液固定，置于-20℃过夜，PBS(pH 7.0)洗2次，2 000 rpm离心5 min，弃去上清。加入100 μL碘化丙锭染色液室温染色30 min，PBS(pH 7.0)洗2次，2000 rpm离心5 min，弃去上清。加入100 μL PBS(pH 7.0)悬浮细胞，经流式细胞仪检测细胞凋亡比率和细胞周期。

1.3　统计学分析

2结果

2.1　细胞增殖抑制作用

不同浓度和不同时间点的EGCG和EGCG联合RA对HeLa细胞的增殖的影响作用见表1。结果显示，与单独EGCG相比，各种剂量组EGCG联合RA在4h和8h时对HeLa细胞的增殖具有显著抑制作用。同时，无论是单独EGCG组还是EGCG联合RA组的抑制作用具有时间依赖性，除5mg/L剂量组外，其他各剂量组随作用时间的延长，抑制作用增强，而作用8h以后出现下降趋势，但并没有显著差异(图1)。EGCG和EGCG联合RA对HeLa细胞增殖的抑制作用具有明显浓度依赖性，从5μmol/L起对HeLa细胞增殖的抑制效应逐渐增加(图2)。此外，利用SPSS19.0软件分析浓度-抑制率相关性，求得的抑制率应用SPSS软件作直线回归分析，将抑制率=50代入方程求出EGCG组在2、3、8、16、32h时的半数抑制浓度IC50分别为38.02、31.29、31.84、32.20、33.39μmol/L，而EGCG联合RA组在这些时间点的IC50明显低于单独EGCG组，分别为37.90、27.20、27.24、30.65、31.37μmol/L(表2)。

表1　不同剂量EGCG和EGCG联合RA对HeLa细胞增殖的抑制作用(%)

注：与EGCG比较，*P<0.05为差异显著；**P<0.01为差异极显著。下同

A：EGCG； B：EGCG+RA

A：EGCG；B：EGCG+RA

EGCG(μmol/L)510204080EGCG38.0231.2931.8432.2033.39EGCG+RA37.9027.2027.2430.6531.37

2.2　细胞毒性

通过检测细胞培养液上清中LDH的活力判断其释放率，以评价EGCG和EGCG联合RA对HeLa细胞的毒性作用。无论是单独EGCG组还是EGCG联合RA组对HeLa细胞的毒性作用具有浓度依赖性，除5 mg/L剂量组外，其他各剂量组随作用时间的延长毒性作用增强。同时这种作用还具有时间依赖性，作用时间为24 h时，细胞毒性作用强于12 h。而对于培养液中加入RA后，无论是作用12 h还是作用24 h的细胞毒性作用均有一定程度增强(图3)。

2.3　细胞凋亡

通过显微镜观察不同剂量EGCG和EGCG联合RA诱导HeLa细胞死亡的形态学特征。空白对照组连接紧密、饱满透亮，与空白对照组相比，所有药物组干预HeLa细胞12 h后，可以观察到HeLa细胞的细胞形态发生了典型的细胞凋亡变化，如细胞失去正常形态、变圆，折光性减少，细胞表明无光泽、变粗糙，同时细胞发泡，出现核浓缩和核破裂现象。培养液中加入RA后，这些现象有所增强，并且上清液中有较多的细胞碎片。

与空白对照组相比，无论是单独EGCG组还是EGCG联合RA组诱导HeLa细胞的凋亡率明显升高，并且随着浓度增加呈不断增强趋势，但40 μmol/L和80 μmol/L无明显差异。与单独EGCG组相比，EGCG联合RA低浓度组对HeLa细胞凋亡率无明显影响，但20、40、80 μmol/L组诱导HeLa细胞凋亡明显增加(表3)。

表3　EGCG和EGCG联合RA对HeLa细胞凋亡的影响(%)

图3　EGCG和EGCG联合RA对HeLa细胞的毒性作用

2.4　细胞周期分析

各剂量EGCG和EGCG联合RA处理HeLa细胞12 h后，对照组和不同浓度实验组细胞周期分布见表4。无论是单独EGCG组还是EGCG联合RA组不同剂量处理HeLa细胞后细胞周期均被阻断在G0/G1期，S期所占比率明显下降，并且随着浓度增加呈不断增强趋势。培养液中加入RA后，仅高浓度组(20、40、80 μmol/L)与单独EGCG组相比作用明显增强。

表4　EGCG和EGCG联合RA对HeLa细胞周期的影响(%)

3讨论

绿茶中含有多种茶多酚活性成分物质，主要有8种单体：EGCG、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、儿茶素没食子酸酯(CG)、没食子儿茶素(GC)、儿茶素(C)。茶多酚具有降脂、降血糖、抗氧化等药理学作用，此外，研究资料显示，包括皮肤癌、肺癌、口腔癌、食管癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌等在内的体外细胞和体内动物模型实验证明了茶多酚具有抑制肿瘤的作用[4]。其中，EGCG含量最高，占茶多酚制品的40%-50%，同时也是绿茶中抗肿瘤活性最强的成分，EGCG可从诱导凋亡、周期阻滞、信号传导等多种途径发挥抗癌作用，目前发现EGCG对前列腺癌、肺癌、白血病、鼻咽癌、大肠癌、宫颈癌等肿瘤细胞均有抑制作用，因此，EGCG已经被列为一种抗癌新药在许多国家进行研究，显示出了很好的应用前景。

宫颈癌是全球范围威胁女性健康的的三大恶性肿瘤之一[5]。它的发展分为不同的阶段，逐渐出现严重肿瘤发展前期的异性增生，即宫颈上皮成瘤的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期。虽然宫颈腺癌较鳞癌少见，但近年来，宫颈腺癌的发病率及其在宫颈癌中所占比例不断上升，且发病趋于年轻化，预后比同期鳞癌差。同时，宫颈腺癌更具有侵染的生物活性，卵巢转移率高于鳞癌，同时愈后不良、淋巴结转移以及对放射电离和化学治疗不敏感等。临床治疗方面除了常规的手术、放化疗之外，并无太多有效的治疗策略[6]。许多体内和体外研究表明，日常饮食中摄入多酚类物质不仅具有抗氧化作用，而且还能预防肿瘤。体外研究显示，EGCG对宫颈腺癌细胞TMCC-1这种细胞系的生长具有抑制作用，有效的IC50为100 μM，同时具有诱导这种细胞凋亡的作用。本研究结果表明，EGCG对HeLa细胞的增殖具有抑制作用，且这种作用具有时间和浓度依赖性，在2、3、8、16、32 h时的IC50分别为38.02、31.29、31.84、32.20、33.39 μmol/L。EGCG不同剂量处理HeLa细胞后细胞周期均被阻断在G0/G1期，可诱导HeLa细胞凋亡，高浓度时凋亡率达到42.35%。

维生素A在调节细胞生长和分化中起着重要作用，因此一直认为维生素A在预防和治疗肿瘤方面有着潜在的作用。维生素A具有生物活性的分子形式是视黄醇、视黄醛和RA，其中RA又称维生素甲酸、维甲酸、异维A酸等，是动物体内维生素A的代谢中间产物。RA最早用于寻常性痤疮、扁平苔癣(包括口腔扁平苔癣)、白斑、毛发红糠疹、面部单纯糠疹和牛皮癣等皮肤病。而自20世纪80年代中期我国学者首先利用全反式维甲酸通过诱导细胞分化有效治疗急性早幼粒细胞白血病以来，视黄酸抗肿瘤的研究一直受到各国学者的高度重视。虽然RA抗肿瘤的机理至今仍未阐明，但研究显示，RA对成神经细胞肿瘤、胃癌、卵巢癌、宫颈癌等的增殖具有抑制作用、可诱导肿瘤细胞分化和凋亡、增加癌细胞对化疗药物的敏感性、促进免疫细胞的增殖以及增强免疫细胞对肿瘤细胞杀灭作用[7]。虽然RA对肿瘤细胞有良好的治疗效果，但是其毒性太大，水溶性差以及给药靶向性差等缺点，限制了其在临床上的进一步应用，因此更多的临床应用研究是联合其他抗肿瘤药物。本文结果也显示，RA能够显著增强EGCG对HeLa细胞增殖的抑制作用，在2、3、8、16、32 h时的IC50分别为37.90、27.20、27.24、30.65、31.37 μmol/L。并且RA能够显著增强EGCG阻断HeLa细胞的细胞周期在G0/G1期，可诱导HeLa细胞凋亡，40 μmol/L和80 μmol/L诱导HeLa细胞的凋亡率分别达到45.18%和45.89%。

因此，RA能够显著增强EGCG抑制宫颈腺癌HeLa细胞的增殖，提示二者联合用药可通过抑制细胞周期进程和促进细胞凋亡来发挥其HeLa细胞的协同抑制作用，为其临床应用提供了新的策略。

参考文献：

[1]表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗肿瘤研究进展[J].中国肿瘤，2006，15(7)：453.

[2]滕翠琴，龚受基，刘仲华.绿茶成分EGCG 抗肿瘤作用研究进展[J].茶叶通讯，2012，39(4)：8.

[3]史得发，唐建斌，隋梅花，等.维A酸衍生物抗癌药物的研究进展[J].中国药学杂志，2013，48(5)：321.

[4]杜玉，娄红祥.表没食子儿茶素没食子酸酯药理作用研究进展[J].国外医药·植物药分册，2006，21(6)：244.

[5]李宁，吴令英.宫颈腺癌的治疗进展[J].癌症进展杂志，2009，7(2)：122.

[6]李清，冯炜炜.宫颈腺癌的研究进展[J].国际妇产科学杂志，2012，39(4)：330.

[7]Duwster G.Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis [J].Cell,2008,134(6):921.

摘要：目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)联合视黄酸(retinoic acid, RA)对宫颈腺癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法将1×105的HeLa细胞接种于96孔培养板，分实验组(添加终浓度5、10、20、40、80 μmol/L的EGCG或同时含有终浓度0.1 μmol/L的RA)和空白对照组。MTT法检测EGCG或联合RA对HeLa细胞增殖的影响。LDH检测试剂盒检测EGCG或联合RA对HeLa细胞的毒性。流式细胞仪分析EGCG或联合RA对HeLa细胞周期和凋亡的影响。结果与单独EGCG相比，各种剂量组EGCG联合RA对HeLa细胞的增殖具有显著抑制作用，这种作用具有时间和浓度依赖性。EGCG联合RA组(37.90、27.20、27.24、30.65、31.37 μmol /L)在2、3、8、16、32 h时的半数抑制浓度IC50明显低于EGCG组(38.02、31.29、31.84、32.20、33.39 μmol /L)。同时，无论是单独EGCG组还是EGCG联合RA组对HeLa细胞的毒性作用也具有时间和浓度依赖性，而相对于单独用药，联合RA无论是作用12 h还是作用24 h的细胞毒性作用均有一定程度增强。此外，流式细胞仪检测结果显示，无论是单独EGCG组还是EGCG联合RA组不同剂量处理HeLa细胞后凋亡率明显升高且细胞周期均被阻断在G0/G1期，S期所占比率明显下降，而联合组较单独组呈增强趋势。结论RA能够增强EGCG抑制宫颈腺癌HeLa细胞增殖并诱导其凋亡，且使其周期阻断于G0/G1期。

关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯；视黄酸；宫颈腺癌；增殖

The study of antiproliferative effect of EGCG combined with RA on cell of cervical adenocarcinoma.LIJie.(LaiwuMaternalandChildCareServiceCentre,Laiwu271100,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of epigallocatechin gallate (EGCG) combined with retinoic acid (RA) on the proliferation and apoptosis of Hela cell of cervical carcinoma.Methods1×105Hela cells were inoculated in 96-well culture plates, the cells were divided into experimental group (including EGCG with final concentration of 5 μmol /L, 10 μmol/L, 20 μmol /L, 40 μmol /L and 80 μmol/L, or at the same time including RA with final concentration of 0.1 μmol/L) and control group. The method of MTT was used to test the effect of EGCG of combined with RA on proliferation of Hela cells, and the method of LDH was used to test the toxic effects of EGCG or combined with RA on Hela cells, flow cytometry (FCM) was used to analyzed the effect of EGCG of combined with RA on the cycle and apoptosis of Hela cells.ResultsEvery-dosage group of EGCG combined with RA had the remarkable inhibiting effects on the proliferation of Hela cells in concentration-and time-dependent manners comparing to the alone EGCG group. Inh ibitory concentration (IC50) of EGCG combined with RA group (37.90、27.20、27.24、30.65、31.37 μmol/L)significantly lower than the alone EGCG group (38.02、31.29、31.84、32.20、33.39 μmol/L) in 2、3、8、16、32 h respectively. And the toxic effects of alone EGCG group and EGCG combined with RA both depended on the time of effects and concentration of EGCG of RA. Comparing to alone EGCG, the toxic effects of EGCG combined with RA on Hela cells strengthen to a certain extent on 12h and 24h respectively. The results of FCM indicated the effects of different doses of EGCG on Hela cells can remarkably increase the apoptosis rate of cell and the cell circle was blocked on G0/1 period no matter alone EGCG or EGCG combined with RA groups, but the rate of S period declined obviously, and the the EGCG combined RA group had the enhance trend comparing to alone EGCG group.ConclusionRA can increase the inhibiting effect of EGCG on proliferation of Hela cell of cervical carcinoma, and reduce it's apoptosis and block the cell on G0/G1 period.

Key words:Epigallocatechin gallate; Retinoic acid; Cervical adenocarcinoma; Proliferation

收稿日期：(2013-11-26)

作者简介：李杰(1973-)，女，大学本科，主治医师，长期从事妇科的临床和研究工作。

文献标识码：A

中图分类号：R737.33

文章编号：1007-4287(2015)04-0547-05