新生儿干血斑β地中海贫血筛查方法的研究

黄烁丹,张惠琴,邹　婕,庄宇嫦,熊　蓉,吴　维,徐　怡,肖砚微,邹秀齐

(1.梅州市妇幼保健院，广东 梅州514021；2.梅州市人民医院，广东 梅州514021)

新生儿干血斑β地中海贫血筛查方法的研究

黄烁丹1,张惠琴2,邹婕1,庄宇嫦1,熊蓉1,吴维1,徐怡1,肖砚微1,邹秀齐1

(1.梅州市妇幼保健院，广东 梅州514021；2.梅州市人民医院，广东 梅州514021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0582)

地中海贫血(简称“地贫”)又称珠蛋白生成障碍性贫血，是我国华南地区高发的遗传性溶血性疾病，亦是南方地区重点防治的单基因遗传病[1-3]，由β珠蛋白基因异常导致β珠蛋白肽链合成缺乏称为β地贫。采取现代化先进技术，通过有效模式对新生儿进行β地贫早期筛查和干预，意义重大。目前，国内未见大规模新生儿β地贫筛查的报道，缺乏较成熟的筛查方法和工作模式，本研究应用新生儿疾病筛查的滤纸干血斑标本，采用全自动毛细管血红蛋白电泳技术，建立了一套用于新生儿β地贫筛查的综合分析法，现将研究结果报道如下。

1样本与方法

1.1　样本

1.1.1样本采集 2012年1月至2013年12月，按照新生儿疾病筛查标本采集技术规范，对145904例在梅州市各医疗保健机构出生的新生儿，于出生后3-7天，在知情同意的情况下采集足跟血血斑标本，递送至本机构进行电泳筛查，并对筛查阳性者召回进行基因诊断。

1.1.2标本分组从2012年1月至2013年3月采集的95059例标本用“HbA界值法” 筛查β地贫；从2013年4月-12月采集的50845例标本用 “综合分析法”筛查β地贫；2013年4月采集的标本中随机抽取600例标本同时用 “HbA界值法”和“综合分析法”筛查β地贫，血斑标本同时进行地贫基因检测。

1.2　仪器与试剂

1.2.1血红蛋白分析采用法国Sebia公司的Capillarys 2全自动毛细管电泳仪及配套血红蛋白电泳试剂盒。

1.2.2基因检测基因扩增仪、分子杂交仪及β地贫基因诊断试剂盒 (广东凯普生物技术有限公司提供)。

1.3　新生儿干血斑血红蛋白电泳

1.3.1血红蛋白电泳从滤纸干血斑打下一个4.84 mm2血斑片，置于50 μL 蒸馏水的测试杯中溶解，保湿过夜，第二天将准备好的测试杯直接放入Sebia Capillarys 2全自动毛细管电泳仪中检测，按照仪器的操作规程完成标本检测。

1.3.2根据Sebia Capillarys 2全自动毛细管电泳仪报告的结果分别统计每个标本的HbA、HbA2的含量。

1.4　β地贫筛查阳性的判读

1.4.1HbA界值法根据血红蛋白组分HbA的含量判断β地贫筛查阳性，电泳结果如HbA≤9.5%(切值为厂家提供)或出现HbE则判断为β地贫筛查阳性，如HbA < 2.5%，则疑为重型β地贫。

1.4.2综合分析法根据血红蛋白组分HbA含量、HbA2含量及HbA2/HbA比值筛查β地贫阳性，具体方案如表1所示。

表1　综合分析法β地贫筛查阳性判断表

*注：筛查时若出现HbE，直接判断为筛查阳性。

1.5　基因检测

采用聚合酶链反应-反向点杂交(PCR-RDB)技术进行南方地区常见的16种β珠蛋白基因点突变分析，检测的突变位点包括41-42、IVS-II-654、-28、71-72、17、βE、31、IVS1-1、27/28、43、-29、-30、14-15、CAP、Int和IVS1-5。

1.6　统计分析

数据采用MedCalc 12.3.0软件包进行处理。以基因诊断结果为β地贫诊断标准，分别统计分析HbA界值法和综合分析法的诊断敏感度、特异度、准确性及假阳性率，卡方检验(χ2)比较两者的诊断价值，以P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1新生儿干血斑血红蛋白毛细管电泳结果

如图1所示，新生儿干血斑毛细管电泳可精确分离并检测Hb Bart’s、HbA、HbF和HbA2等血红蛋白组分。用配套软件将HbA2区放大后进行判读，可灵敏检测到含量<0.1%的HbA2。

2.2筛查结果阳性的血红蛋白电泳图谱图2和图3分别显示利用HbA界值法和综合分析法筛查结果为阳性的血红蛋白电泳图，图示中的标本均经过基因检测确诊为β地贫。

2.3HbA界值法筛查阳性的基因确诊符合率

采用HbA界值法筛查的95059例标本中阳性3941例，筛查阳性率4.1%，召回筛查阳性者1580例进行了地贫基因检测，确诊为β地贫716例，符合率45.32%，假阳性率54.68%。其中召回的13例HbE全部确诊为轻型β地贫(βE杂合子)，符合率为100%；召回的37例筛查疑为中重型β地贫者有35例确诊为β地贫纯合子或双重杂合子(2例为杂合子)，中重型β地贫符合率为94.6%，β地贫符合率为100%。结果见表2。

图1毛细管电泳可准确的检测新生儿干血斑标本中的

Hb Bart`s、HbA 、HbF、HbA2

图2　HbA界值法筛查阳性图　 A、B为两个不同的阳性筛查结果，A疑为重型β地贫。

图3　综合分析法筛查阳性图

表2　HbA界值法筛查阳性召回基因确诊结果统计表

2.4综合分析法筛查阳性的基因确诊符合率

采用综合分析法筛查的50845例标本中阳性2032例，筛查阳性率4.0%，召回筛查阳性者1266例进行基因检测，确诊为β地贫930例，符合率73.46%，假阳性率26.54%。15例筛查疑为中重型β地贫者有14例确诊为β地贫纯合子或双重杂合子(1例为轻型)，中重型β地贫符合率93.3%，β地贫为100%。结果见表3。

表3　综合分析法筛查阳性召回基因确诊结果统计表

2.5HbA界值法和综合分析法的对比研究

从2.3和2.4的结果中，我们发现两种方法的筛查阳性率无明显差异，但综合分析法筛查阳性与基因检测结果的符合率明显高于HbA界值法，但由于上述的结论是针对不同的标本，因此我们采用HbA界值法和综合分析法分别对600例标本同时进行筛查和基因检测，其中β地贫22例，阴性578例，HbA界值法与综合分析法的筛查结果如表4所示。表5显示了两种方法的筛查能力比较。结果表明，综合分析法敏感度、阳性预测值和筛查的准确性显著高于HbA界值法(P均<0.05)，综合分析法的的特异性和阴性预测值略高于HbA界值法(0.01>P>0.05)。

表4　HbA界值法与综合分析法对600例标本的筛查结果

表5　HbA界值法与综合分析法诊断能力比较

3讨论

正常新生儿的HbF约占70%，HbA 约占30%，HbA2少于1%[4]。地贫患儿的各种Hb组分和含量会发生变化，通过分离技术分析各种血红蛋白的成分和含量，从而判断是否为地贫。新生儿干血斑标本被广泛应用于多项新生儿出生疾病的筛查，不仅取血方便，且标本易于运输，非常适用于新生儿疾病的常规筛查。目前新生儿地贫筛查多采用脐带血，标本不易保存和运输，限制了新生儿地贫筛查的广泛应用。用于分析新生儿干血斑标本的全自动毛细管血红蛋白电泳分析技术[5]的出现为解决这一难题提供了可能。全自动毛细管血红蛋白电泳分析技术，利用新生儿滤纸干血斑中的微量血红蛋白，在高压电的作用下，在直径为25微米的毛细管中实现不同血红蛋白组分的分离。该技术对各种血红蛋白组分检测敏感、稳定，可准确地检测并定量各种血红蛋白组分，如Hb Bart’s、HbA、Hb F和HbA2等[5-8]，是目前新生儿地贫筛查最简便、有效的技术平台[9]。目前国内尚未见此项技术进行β地贫筛查的研究报道。

正常胎儿从3个月开始合成HbA，至6个月时增加到5%-10%，分娩时可达到35%-40%。β地贫患儿由于β珠蛋白合身障碍，其HbA含量低于正常新生儿，且HbA水平越低提示β地贫越严重，因此，临床常利用HbA含量筛查β地贫[10]。

根据国内外新生儿地贫筛查研究[8-12]，结合作者实验室的临床经验和厂家提供的切值，把HbA<9.5%作为HbA界值法筛查β地贫的初步方案，筛查的阳性率为4.1%，略高于黄烁丹报导的分子流行病学调查结果3.4%[13]。其中，把HbA<2.5%作为重型β地贫的筛查阈值，研究发现，其筛查的重型β地贫新生儿基因确诊符合率是98.1%，证明HbA<2.5%是新生儿重型β地贫的有效筛查指标。对HbA界值法筛查出的全部阳性标本进行基因确诊试验表明，确诊符合率为45.32%，假阳性率54.68%。此结果明显低于陈和平[11]、甘冰[12]等利用琼脂糖电泳检测脐带血HbA含量筛查β地贫的确诊符合率(分别为84.3%和78.4%)。这可能与本研究采用的是新生儿干血斑毛细管电泳法，而他们用的是脐带血琼脂糖电泳法有关，另一方面，干血斑标本是在出生后3-7天采集，脐血是出生时即采，标本采集时机不同可能也有关系。HbA界值法由于假阳性率偏高，造成过多的不必要召回和复诊，给受检者造成不必要的经济和精神负担，分析方法急需改良。

研究中我们发现，HbA界值法筛查阳性标本的HbA含量主要分布在7.4%-9.5%区间，占总筛查阳性数的67.12%，但其确诊符合率仅为34.18%，假阳性率高达65.82%。可见，该区间是造成HbA界值法筛查假阳性率高的主要原因，本研究针对这一部分进行了改良，建立了综合分析法。

综合分析法是在HbA界值法的基础上，结合HbA2的含量、HbA2/HbA比值和HbE建立起来用于新生儿β地贫筛查的毛细管血红蛋白电泳结果分析方法。由于δ珠蛋白的合成开始于妊娠后期，新生儿血液中可出现微量的Hb A2(α2δ2)[8]，β地贫新生儿出现代偿性的δ肽链合成增加或提前出现，使HbA2比例升高或者提前出现。本研究发现采用的全自动毛细管血红蛋白电泳分析技术检测新生儿干血斑标本，可敏感检测出微量HbA2，为综合分析法的建立提供了条件。研究中我们发现，当HbA<7.4%时，HbA2与β地贫无相关性，故综合分析法未把HbA2/HbA比值做为判断指标，此部分阳性者的确诊符合率与HbA界值法接近(63.27% vers 64.67%)；而针对HbA在7.4%-9.5%区间的阳性者，综合分析法引入HbA2/HbA比值作为筛查指标之一，确诊符合率明显提高(66.41% verse 34.18%)，显著降低了此区间的假阳性率。针对HbA界值法无法筛查的HbA >9.5%的新生儿标本，综合分析法创新性的结合HbA2/HbA比值，其筛查出的阳性标本确诊符合率高达82.1%，这部分属于HbA界值法无法筛查到的漏筛病例。经上述初步试验结果表明，综合分析法总的确诊符合率提高到73.46%，假阳性率降低至26.54%，明显优于HbA界值法。

鉴于综合分析法的初步评估试验与HbA界值法的评估试验来源于不同的标本，为进一步明确两种血红蛋白电泳分析方法筛查β地贫的优劣，我们利用HbA界值法和综合分析法分别对600例样本同时进行筛查，并全部进行基因检测。结果表明，综合分析法的敏感度、阳性预测值和筛查准确性显著高于HbA界值法(P均<0.05)，特异性和阴性预测值也是综合分析法高于HbA界值法。

综上所述，新生儿干血斑的全自动毛细管血红蛋白电泳技术简便、易用，包括HbA、HbA2和HbA2/HbA比值的综合分析法可显著提高筛查β地贫的敏感度和准确性。综合分析法值得通过目前已较完善的新生儿疾病筛查网络大力推广，以实现大规模的地贫筛查和防控。

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摘要：目的探讨全自动毛细管微量血红蛋白电泳技术在新生儿β地中海贫血筛查中的应用价值，并寻求有效的筛查方法。方法使用Sebia全自动毛细管电泳仪对145904例新生儿滤纸干血斑标本进行血红蛋白(Hb)电泳；对95059例标本的电泳分析结果以HbA界值法判读β地贫筛查结果，对50845例标本的电泳分析结果以HbA值结合HbA2/HbA比值的综合分析法判读β地贫筛查结果，召回筛查阳性者进行地贫基因诊断；随机对600份标本的电泳结果同时以上述两种方法判读β地贫筛查结果，同时进行基因检测作为β地贫诊断的金标准，统计比较两种判读方法的差异。结果HbA界值法筛查出的1580例阳性标本中经基因检测确诊为β地贫的有716例，确诊符合率45.32%，假阳性率为54.68%；综合分析法筛查出的1266例阳性标本中930例经基因检测确诊为β地贫，符合率73.46%，假阳性率为26.54%。同时对600例新生儿干血斑分析结果表明，HbA界值法和综合分析法的敏感度和特异度分别是54.55%、90.91%和97.58%、99.31%，两者的筛查准确性分别为96%和99%。统计结果表明，综合分析法的敏感度、阳性预测值和筛查的准确性显著高于HbA界值法.结论新生儿干血斑标本经毛细管血红蛋白电泳后，利用包含HbA、HbA2组分的含量及HbA2/HbA比值的综合分析法判读电泳结果，筛查新生儿β地贫，灵敏度和准确性显著提高，假阳性率明显降低，值得推广应用。

关键词：β地中海贫血；毛细管电泳；新生儿；干血斑

The study of beta-thalassemia screening methods of Neonate dry blood spot samplesHUANGShuo-dan,ZHANGHui-qin,ZHOUJie,etal.(1.MaternalandChildHealthHospitalinMeizhou,Meizhou514021China)

Abstract:ObjectiveEvaluate the application of capillary hemoglobin electrophoresis in neonate beta-thalassemia screening.MethodsThe Hb electrophoresis of 145904 dry neonatal blood samples was analyzed on Sebia Capillary Neonate Fast.The HbA cut-off value (Method I) was used to screen beta-thalassemia for 95059 dry blood samples and the combination of HbA value and HbA2/HbA ratio (Method II) was used to screen beta-thalassemia for the remaining 50845 dry blood samples.The subjects with positive results were recalled and confirmed by genotyping test.The 600 dry blood samples were collected randomly and the Hb electrophoresis results were check by both of Method I and Method II.The genotyping test was the reference to analyze the difference of both of the methods.ResultsThe genetic diagnosis results of recalled 1580 positive cases according to the Method I showed that the true positive were 716 cases with true positive rate 45.32% and false positive rete 54.68%.The 930 cases were verified by genetic diagnosis among the recalled 1266 cases according to the Method II with true positive rate 73.46% and false positive rete 26.54%.The results of 600 samples showed that the sensitivity and specificity for beta-thalassemia screening of Method I and Method II were 54.55%、90.91%和97.58%、99.31% respectively.The true positive rates were 96% and 99% for Method I and Method II respectively.The results demonstrated that the Method II is superior to Method I for beta-thalassemia screening.ConclusionAfter the capillary dry blood Hb electrophoresis analysis,the combination of HbA value and HbA2/HbA ratio method for beta- beta-thalassemia screening is more sensitive and specific and lower false positive rate than HbA cut-off value method and the combination of HbA value and HbA2/HbA ratio method should be applied to more areas for newborn screening.

Key words:beta-thalassemia; capillary electrophoresis; neonate; dry blood spot

收稿日期：(2014-06-20)

作者简介：黄烁丹，男，38岁，副主任技师，遗传中心主任，医务科副科长,研究方向是新生儿遗传代谢病筛查和早期干预技术。

文献标识码：A

中图分类号：R556.6+1

文章编号：1007-4287(2015)04-0582-05

基金项目：广东省医学科学基金立项课题(A2012762)