肾穿刺活检病理PASM染色方法改良探讨

肾穿刺活检病理PASM染色方法改良探讨

曲乐1，刘树军1，徐进2，高丹1，娄岩1*

(1.吉林大学第二医院 肾病内科,吉林 长春130041；2.北京大学第一医院 电镜室)

目前肾穿刺活检是肾病内科诊断肾脏疾病的主要方法[1-3]。在肾穿刺活检病理诊断中，显示肾小球基底膜病变及免疫复合物定位主要采用PASM (Periodic Acid-SilverMethenamine) 染色法。在临床实践中发现，传统的PASM染色法染色效果不佳，不能显示免疫复合物沉积的情况，基底膜显色较重，背景较深，染色时间过长，并且常有杂质粘附于组织表面，影响临床病理诊断。针对以上问题，本实验对染液的配制方法、染色条件及切片的厚度进行了调整。总结出配方合理、染色稳定和可重复性强的染色方法。

1材料与方法

1.1标本处理与分组随机选取吉林大学第二医院肾病内科肾穿刺活检组织标本256例，经10%中性福尔马林溶液固定24 h，组织常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，切片厚度为1 μm，63℃烤片4.5 h。将标本随机分为两组，每组为128例，分别用传统PASM染色方法和改良PASM染色方法染色，在同一时间，同一环境下进行染色，染色结果由经验丰富的病理医师采用双盲进行评价。

1.2染液配置方法

1.2.1传统六氨银溶液配制方法3%六次甲基四胺水溶液25 ml，加入5%硝酸银水溶液2.5 ml，震荡至乳白色悬浊液变为清亮透明，加入5%四硼酸钠5 ml，加入22.5 ml蒸馏水，最后加入4%硼酸7滴，混匀后过滤立即使用，如果不立即使用放入4℃冰箱避光储存。

1.2.2改良六氨银溶液配制方法3%六次甲基四胺水溶液25 ml，加入2%四硼酸钠5 ml，加入5%硝酸银水溶液2.5 ml，震荡至乳白色悬浊液变为清亮透明，加入30 ml蒸馏水，最后加入4%硼酸5滴，混匀后过滤立即使用，如果不立即使用放入4℃冰箱避光储存。

1.2.3Masson染液配制方法3.2 g磷钨酸、4 ml冰醋酸、2.4 g变色酸2R及1.5 g亮绿，依次逐一加入400 ml的蒸馏水中，混匀后备用。

1.3PASM染色方法1μm组织切片脱蜡至水；1%过碘酸氧化5 min；蒸馏水冲洗2 min；置切片于新鲜配制的六氨银作液中，于65℃温箱中加温20-30 min肉眼见切片呈褐黄色，镜下见肾小球基底膜呈黑色为止；根据银染情况选择性的用0.1%氯化金分化，3%硫代硫酸钠定影15 s，蒸馏水洗2 min；经苏木精染核5-6 min，蒸馏水冲洗2 min；1%盐酸酒精水溶液分化数秒，自来水洗2min；弱氨水返兰数秒；Masson染液套染数秒，镜下观察染色情况适时终止； 高浓度梯度酒精脱水；二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4统计学方法采用SPSS16.0统计软件，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组PASM染色制片质量情况评价128例标本经改良PASM染色，其中2例染色过度，3例染色过浅，1例多余银颗粒杂质沉积，共计6例制片质量不合格，制片质量合格率为95.31%。128例标本经传统PASM染色，33例染色过度，1例染色过浅，25例含有多余银颗粒沉积，59例制片质量不合格，制片质量合格率为61.72%，在银染过度和多余银颗粒杂质沉积两项评价指标中，改良PASM染色法制片质量优于传统PASM染色法，其中银染过浅评价指标中显示两种方法差异无统计学意义，银染过浅情况发生率极低(见表1)，造成银染过浅的原因除了时间的因素外，是否与试剂的批号有关需做进一步研究。

表1　两组PASM染色制片质量情况评价(例数)

2.2肾组织石蜡切片的改良PASM染色方法和传统PASM染色方法染色效果比较改良PASM染色结果显示基底膜、网状纤维、IV型胶原呈黑色，且“勾勒”清晰，免疫复合物呈红色，细胞核为呈蓝色，背景呈粉红色、清晰无杂质(图1-A)，而传统的PASM染色结果常使示基底膜六氨银染色过深或过浅，易产生细胞增生和基底膜增厚的假象，并且背景易出现银颗粒杂质(图1-B、图1-C)，不能真实反映出肾脏的病理变化，不利于临床诊断。

A：染色适中；B：染色过深：C：染色过浅且有银颗粒杂质

3讨论

PASM染色的基本原理是肾小球基底膜和系膜区等部位的蛋白多糖被1%过碘酸氧化后暴露出醛基，醛基再与六氨银染液中银离子发生银镜反应，然后再套以Masson三色染色，染色结果能够清晰地显示基底膜、系膜的病变和免疫复合物沉积的情况[4]。肾脏疾病常导致基底膜和系膜区的改变，所以PASM染色质量的好坏对临床诊断有很大影响[5]。

在临床工作中发现PASM染色受很多因素的影响。与传统PASM染色方法相比，改良PASM染色方法降低了六氨银溶液的硝酸银、硼酸浓度，使得切片组织在银染时更温和，着色更适度，更易于控制，不至于出现染色过深、染色过浅及多余银颗粒沉积的现象。同时，改良的PASM染色方法调整六氨银溶液的配制顺序，先将硼砂加入六次甲基四胺中，使溶液碱化后再加入硝酸银，因为碱化的六次甲基四胺硼砂液削弱六次甲基四胺鳌合银离子的稳定性，使银离子极易被游离的醛基还原成棕黑色的沉淀[6]，与传统PASM染色方法相比，改良PASM染色方法较快，而且稳定，适用于临床推广。

对于改良PASM染色方法中出现极少数银染过度、银染过浅的情况，在工作中还应注意以下重要6点：1)充分氧化组织：肾组织切片需用1%过碘酸充分氧化，保证蛋白多糖充分暴露醛基，进而能够与银离子充分结合。2)孵育温度：孵育温度是PASM染色最重要的一个环节，经过大量实验摸索，孵育温度控制在65℃左右，银染效果最佳，温度偏低标本不宜着色，病理玻片会出现多余银颗粒沉积；温度偏高则容易导致标本着色过度。3)染液中银离子浓度：硝酸银浓度要适中，如果硝酸银浓度过高不利于染色的控制；硝酸银浓度过低容易使六氨银溶液变浑浊，并出现氯化金难以去除的黑色反光膜[4]，致使切片背景较脏不利于诊断。4)孵育时间：切片1 μm厚度，一般在改良的六氨银染液孵育时间为30 min左右，在孵育的过程中及时观察，根据个人经验适时终止孵育，然后根据银染情况选择性的用0.1%氯化金分化，以求达到最佳效果。5)所用配液器皿必须保证清洁，无杂质，配液之前充分刷洗，并用蒸馏水冲洗2-3 min。6)为保证配制的试剂染色效果良好、延长试剂使用期限，所用试剂均放在4℃冰箱冷贮。

总之，改良PASM染色能够收到良好的染色效果，并适合在临床应用推广。但同时要控制切片组织的氧化、孵育温度和孵育时间等因素，才能避免极少数病例银染过度、过浅和多余银杂质颗粒沉积等问题。

参考文献：

[1]娄岩，刘树军，高丹，等．改良冷配Schiff染液在肾穿刺活检病理检查中的应用[J]．中国实验诊断学，2014,18(9)：1507.

[2]柳长青，刘树军，林萍，等．肾穿刺活检患者肾脏疾病临床病理特点-附1600例资料分析[J]．中国实验诊断学，2013,17(6)：1101.

[3]刘树军，周立英，王连有，等．肾脏穿刺病理标本染色方法探讨[J]．中国实验诊断学，2007,11(9)：1242.

[4]戚晓东.肾小球基底膜 PAMS 染色方法的应用体会[J]．诊断病理学杂志，2012，19(2)：159.

[5]吕增华，张杨杨，朱玉红．肾穿刺活检六胺银染色套染 Masson 染色方法的改良[J]．临床与实验病理学杂志,2012,28(12):1289.

[6]李继承主编．组织学与胚胎学实验技术(第1版)[M].北京：人民卫生出版社，2010:49-51．

收稿日期：(2013-11-19)

文章编号：1007-4287(2015)04-0617-03

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