Klotho基因多态性在海南黎、汉族冠心病人群中的表达特征研究

周君霞



·论著·

Klotho基因多态性在海南黎、汉族冠心病人群中的表达特征研究

周君霞

目的 探讨Klotho基因多态性在海南黎、汉族冠心病人群中的表达特征。方法 选取2013年1月—2014年12月在海口市人民医院心内科住院的黎族冠心病患者48例和汉族冠心病患者52例为冠心病组，及同期在该院体检中心进行体检的黎族健康人群50例和汉族健康人群50例为对照组，记录各组性别、年龄、体质指数(BMI)及血压、血脂、血糖水平，检测Klotho基因G395A位点多态性和Klotho蛋白水平。结果 黎族、汉族冠心病组BMI、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与各自对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。黎族冠心病组与对照组GG、GA、AA基因型和G、A等位基因分布间差异均无统计学意义(P>0.05)；汉族冠心病组与对照组GG、GA、AA基因型和G、A等位基因分布间差异均有统计学意义(P<0.05)。黎族冠心病组与对照组GG、GA、AA蛋白表达水平间差异均无统计学意义(P>0.05)；汉族冠心病组与对照组GG、GA、AA蛋白表达水平间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 在汉族冠心病人群中，Klotho基因多态性和蛋白表达水平与冠心病有关，G395A位点AA基因型易患冠心病，GG基因型可能对冠心病有保护作用。在黎族冠心病人群中，Klotho基因多态性和蛋白表达水平与冠心病无明显关系。

Klotho基因；冠心病；黎族；汉族；表达特征

周君霞.Klotho基因多态性在海南黎、汉族冠心病人群中的表达特征研究[J].中国全科医学，2015，18(25)：3065-3068.[www.chinagp.net]

Zhou JX.Expression features of Klotho gene polymorphism among Li and Han people with coronary heart diseases in Hainan Province[J].Chinese General Practice，2015，18(25)：3065-3068.

Klotho基因是1997年新发现的一种与人类衰老密切相关的基因，主要在肾脏和脑脉络膜中表达，推测可能与高血压、动脉硬化、肾功能减退等衰老性疾病有关[1-2]。国外针对不同种族人群的多项研究显示，Klotho基因中包括F352V和C370S等多个位点突变，改变Klotho蛋白的功能，与冠心病密切相关[3-4]。国内一项针对汉族人群的研究显示，Klotho基因中G395A、F352V多态分布与高血压、高血脂等密切相关[5]。目前关于Klotho基因在我国冠心病人群中表达特征的研究较少。故本研究对海南黎族、汉族冠心病患者中Klotho基因G395A位点多态性进行检测，旨在揭示Klotho基因的表达特征，为冠心病的诊治提供新思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2013年1月—2014年12月在海口市人民医院心内科住院的黎族冠心病患者48例和汉族冠心病患者52例为冠心病组，受试者均经冠状动脉造影证实存在1支及以上冠状动脉狭窄≥50%。另选取同期在该院体检中心进行体检的黎族健康人群50例和汉族健康人群50例为对照组，均无心悸、胸闷、胸痛等冠心病临床表现，心电图、超声心动图等检查显示无缺血性心脏病改变。黎(汉)族判断标准为：祖籍为黎(汉)族且三代以内父母均为黎(汉)族。本研究经过该院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 资料收集 记录所有受试者性别、年龄、体质指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)，使用全自动生化分析仪(日立-7600)测定总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖(FPG)等指标。

1.3 Klotho基因多态性检测

1.3.1 DNA提取 取外周静脉血2 ml，乙二胺四乙酸二钾(EDTAK2)抗凝，使用人血液基因组DNA抽提试剂盒(大连宝生工程有限公司)操作，方法严格按试剂盒说明书进行。

1.3.2 等位基因特异引物-聚合酶链反应(ASP-PCR) 使用等位基因ASP-PCR技术检测Klotho基因G395A位点多态性。引物序列设计参照美国国家生物信息中心基因库，使用Primer 5.0 Input软件自行设计G395A位点PCR引物序列。Klotho基因G395A上游引物：5-AATCGGCTCCAGCAAT GTCCAG-3′；下游引物：G等位基因5′-AGAAAAGTCGCCGACCAACTTTC-3′，A等位基因5′-AGAAAAGTCGCCGACCAACTTTT-3′(上下游引物由大连宝生工程有限公司合成)。PCR反应体系采用20 μl标准：10×buffer 2 μl，上、下游引物各1.6 μl，耐热DNA(TapDNA)聚合酶0.1 μl，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)1.6 μl，脱氧核糖核酸(DNA)0.3 μl，氯化镁(MgCl2) 1.6 μl，灭菌双蒸水(ddH20)11.2 μl。反应条件为：G等位基因94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35个循环，72 ℃继续延长10 min；A等位基因除退火30 s采用61 ℃外，其余均与G等位基因相同。取PCR产物6 μl加入2%琼脂糖凝胶系统观测PCR扩增效果。G395A位点多态性等位基因型为GG、GA、AA，其PCR扩增产物片段长度为147 bp。

1.4 Klotho蛋白水平测定 采用酶联免疫吸附法测定Klotho蛋白水平，严格按照Klotho蛋白试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)说明书操作，至少测3次，取平均值。

2 结果

2.1 黎族、汉族冠心病组与对照组一般资料比较 黎族冠心病组中男34例，女14例；对照组中男32例，女18例，差异无统计学意义(χ2=0.520，P>0.05)。汉族冠心病组中男36例，女16例；对照组中男32例，女18例，差异亦无统计学意义(χ2=0.313，P>0.05)。黎族冠心病组与对照组年龄、TG、HDL-C、FPG间差异无统计学意义(P>0.05)，而BMI、SBP、DBP、TC、LDL-C间差异有统计学意义(P<0.05)；汉族冠心病组与对照组年龄、TG、HDL-C间差异无统计学意义(P>0.05)，而BMI、SBP、DBP、TC、LDL-C、FPG间差异有统计学意义(P<0.05)；黎族冠心病组与汉族冠心病组FPG间差异有统计学意义(P<0.05)，而其余指标间差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.2 黎族、汉族冠心病组与对照组Klotho基因G395A位点多态性比较 黎族冠心病组与对照组GG、GA、AA基因型和G、A等位基因分布间差异均无统计学意义(P>0.05)；汉族冠心病组与对照组GG、GA、AA基因型和G、A等位基因分布间差异均有统计学意义(P<0.05)；黎族冠心病组与汉族冠心病组GG、GA、AA基因型和G、A等位基因分布间差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3 黎族、汉族冠心病组与对照组Klotho蛋白水平比较 黎族冠心病组与对照组GG、GA、AA蛋白表达水平间差异均无统计学意义(P>0.05)；汉族冠心病组与对照组GG、GA、AA蛋白表达水平间差异均有统计学意义(P<0.05)；黎族冠心病组与汉族冠心病组GG、GA、AA蛋白表达水平间差异均有统计学意义(P<0.05，见表3)。

表1 黎族、汉族冠心病组与对照组一般资料比较±s)

注：BMI=体质指数，SBP=收缩压，DBP=舒张压，TC=总胆固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白胆固醇，HDL-C=高密度脂蛋白胆固醇，FPG=空腹血糖；1 mm Hg=0.133 kPa；与汉族冠心病组比较，aP<0.05

表2 黎族、汉族冠心病组与对照组Klotho基因G395A位点多态性比较

Table 2 Comparison of Klotho gene polymorphism of G395A between CHD group and control group in Li people and Han people

组别例数基因型〔n(%)〕GG GA AA等位基因〔%(n/N)〕G A黎族 对照组5028(56.0)16(32.0)6(12.0)72.0(72/100)28.0(28/100) 冠心病组4825(52.1)a16(33.3)a7(14.6)a68.8(66/96)a31.2(30/96)a χ2值0.2060.248 P值>0.05>0.05汉族 对照组5029(58.0)17(34.0)4(8.0)75.0(75/100)25.0(25/100) 冠心病组5214(26.9)23(44.3)15(28.8)49.0(51/104)51.0(53/104) χ2值12.46614.549 P值<0.05<0.05

注：与汉族冠心病组比较，aP<0.05

Table 3 Comparison of Klotho protein level between CHD group and control group in Li people and Han people

组别例数GGGAAA黎族 对照组5012.9±1.411.5±1.88.1±1.6 冠心病组4812.7±2.2a11.6±2.3a8.3±1.4a t值0.5340.2400.657 P值>0.05>0.05>0.05汉族 对照组5013.2±1.511.3±2.17.9±1.3 冠心病组5211.9±1.99.4±1.36.1±1.5 t值3.8265.4696.466 P值<0.05<0.05<0.05

注：与汉族冠心病组比较，aP<0.05

3 讨论

Klotho蛋白具有广泛的生理功能，如维持细胞膜的完整性、增加血管紧张素转化酶-1的活性、增加唾液酸酶活性、维持肺的结构功能、保护心血管系统等，并随着年龄增长其表达逐渐降低[6]。国外研究证实欧洲人群中Klotho-VS突变纯合子是其早发隐匿性冠心病的独立危险因素；Klotho-VS与SBP和HDL-C有明确相关性，纯合子基因型携带者较杂合子心血管病危险性高，而以突变纯合子基因型携带者危险度最高[7]。Jo等[8]发现在韩国人群Klotho基因G395A位点突变与冠状动脉狭窄呈正相关；而国内在重庆汉族人群中的研究却发现Klotho基因G395A位点突变与其动脉硬化呈负相关[9]。这两种相反结果表明Klotho基因多态性与冠心病的关系可能存在较大的种族差异。故本研究对海南黎族和汉族冠心病人群中Klotho基因G395A位点多态性进行比较。

黎族是海南岛特有的原住民族，与外界交流较少，有特殊的遗传背景和海岛生活方式。国内针对黎族人群的一些心血管病研究已经证实黎族和汉族在某些基因位点上存在差异[10]。本研究选取黎族人群的标准是三代以内父母均为黎族，保证了研究人群的准确性。本研究发现，Klotho基因G395A位点多态性可能与汉族人群冠心病密切相关，汉族人群G395A位点的AA基因型易患冠心病，GG基因型可能对冠心病有保护作用；Klotho蛋白水平在冠心病组中明显降低，提示该基因可能有冠心病保护作用，这与有关文献类似[11]。但是在黎族人群中，并未发现Klotho基因G395A中的GG、GA、AA位点和冠心病有关，仅发现黎族人群Klotho基因GG蛋白表达水平高于GA和AA，但这种趋势在黎族冠心病人群和健康对照人群中均存在。本研究还发现，黎族冠心病组比汉族冠心病组GG基因频率和G等位基因频率明显升高，GA、AA基因频率和A等位基因频率明显降低，GG、GA、AA蛋白表达水平均明显升高，进一步说明 Klotho基因G395A位点多态性对黎族冠心病人群影响作用不明显。

综上所述，在海南汉族人群中，Klotho基因G395A位点多态性与冠心病密切相关，但在海南黎族人群中，G395A位点多态性与冠心病无明显关系，这可能与种族遗传差异有关，是否存在其他机制有待于进一步研究。

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(本文编辑：崔沙沙)

Expression Features of Klotho Gene Polymorphism Among Li and Han People With Coronary Heart Diseases in Hainan Province

ZHOUJun-xia.

DepartmentofCentralLaboratory,HaikouMunicipalPeople′sHospital,Haikou570208,China

Objective To explore the expression features of Klotho gene polymorphism among Li and Han people with coronary heart diseases(CHD).Methods We enrolled 48 Li people with CHD and 52 Han people with CHD who were admitted into the Department of Cardiology of Haikou Municipal People′s Hospital from January 2013 to December 2014 as CHD group.We also enrolled 50 healthy Li people and 50 healthy Han people who received physical examination in the hospital in the same period as control group.Gender,age,body mass index(BMI) and blood pressure,blood lipid and blood glucose level were recorded,and Klotho gene polymorphism of G395A and Klotho protein level were examined.Results There were significant differences between CHD group and control group in Li people and Han people in BMI,systolic blood pressure(SBP)，diastolic blood pressure(DBP),total cholesterol(TC)，low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C).There were no significant differences in the distribution of GG,GA,AA genotypes and G,A alleles between CHD group and control group in Li people(P>0.05);there were significant differences in the distribution of GG,GA,AA genotypes and G,A alleles between CHD group and control group in Han people(P<0.05).There were no significant differences in the protein expression level of GG,GA,AA between CHD group and control group in Li people(P>0.05);there were significant differences in the protein expression level of GG,GA,AA between CHD group and control group in Han people(P<0.05).Conclusion Among Han people with CHD,the polymorphism and protein expression level of Klotho gene are correlated with coronary diseases，AA of G395A is liable to CHD,and GG may have a protective effect from CHD.Among Li people with CHD,there is no remarkable correlation between the polymorphism and protein expression level of Klotho gene and CHD.

Klotho gene;Coronary disease;Li nationality;Han nationality;Expression features

570208海南省海口市人民医院中心实验室

R 541.4

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.25.015

2015-05-21；

2015-07-15)