茶叶联苯菊酯残留降解菌的筛选与鉴定

胡桂萍， 叶武光， 石旭平， 张国彪， 贺望兴， 游艳红， 朱运华

(江西省蚕桑茶叶研究所， 江西 南昌 330202)

茶叶联苯菊酯残留降解菌的筛选与鉴定

胡桂萍， 叶武光， 石旭平， 张国彪， 贺望兴， 游艳红， 朱运华

(江西省蚕桑茶叶研究所， 江西 南昌 330202)

摘要:以茶园常超标农药联苯菊酯为降解对象，采用生物富集、农药驯化等方式从茶园土壤中筛选出高效降解菌LB-1。经过形态学观察、生理生化以及构建系统进化树等方法，初步鉴定该菌株为克雷伯氏菌Klebsiella sp.。菌株LB-1在MSM培养基中呈S型生长，且能以联苯菊酯为唯一碳源，对联苯菊酯显示很强的降解潜能，有望为开发安全、环保的茶叶农药降污剂提供重要的菌株来源，也为其他果蔬农药降污提供理论支持和技术参考。

关键词:茶园； 微生物降解； 联苯菊酯； Klebsiella sp.

茶叶是我国重要的经济作物，2012年我国茶叶产量居世界第一，出口量居世界第二。随着生活水平的提高，人们对茶叶食品安全问题越来越重视(戴平望，2014)。调查显示农药残留超标成为当前我国茶叶出口和内销重要瓶颈。茶叶上常残留和常超标农药有数十种，其中联苯菊酯为茶叶农药超标目录上频率高的农药种类之一。联苯菊酯为一种人工合成的菊酯类超高效杀虫剂，对茶尺蠖等鳞翅目食叶幼虫、茶蚜、小绿叶蝉、茶叶象甲、茶叶螨类等茶树主要害虫具有很强的触杀和胃毒作用，其综合防治害虫效果要优于其他农药，为茶园首选拟除虫菊酯类农药品种(陈宗懋，2002)，但是长期的喷洒，加上联苯菊酯化学性质稳定在环境中不易分解等特点(Laskowski,2002)，且农药被农作物利用率低，导致茶园和茶叶上联苯菊酯残留超标，严重影响茶叶品质，同时也严重危害到人类的健康和生态环境安全。2000年7月1日欧盟(EU)对外宣布开始对茶叶的农药最高残留量(MRL)执行新标准，联苯菊酯的限量一度从5.0 mg联苯菊酯的降到0．1mg联苯，使我国茶叶出口面临着更为严峻的挑战(陈宗懋，2001)。因此，茶叶农药残留问题已成为亟待解决的问题。

自然环境中农药主要是依靠生物和非生物2种途径来实现农药的降解和转化(乔雄梧，1999)，相对于物理、化学降解方法，微生物降解农残因具有安全、绿色、高效和无二次污染等优点，被众多学者认为是处理农药污染的一种新型有效的方法(王兆守和李顺鹏，2005)，目前国内外的研究热点主要集中在从自然环境中分离和筛选出能高效降解农药的微生物，对微生物降解机理以及对微生物降解菌进行改造研究(王伟东等，2005)。研究发现环境中的联苯菊酯可以通过微生物自身酶系统以及分泌的代谢物作用被分解(Singh,2009；Leeetal.,2004)，罗天雄(2009)发现联苯菊酯可能是被降解微生物作为有机碳源而降解且联苯菊酯浓度越高，微生物生长越好。因此土壤微生物在联苯菊酯的降解过程中发挥着重要作用(Zhangetal.,2005;Sogorbetal.,2002;Yuetal.,2003)。但目前已报道的降解微生物均属于异位修复，异位修复存在与本地微生态环境不兼容等问题，加之微生物修复受环境影响大且修复效果不稳定，因此对于可有效降解茶叶上联苯菊酯的微生物还鲜见报道。本研究拟从茶园土壤出发，筛选出可降解联苯菊酯的微生物BCL-1，并对其进行生理生化、16S rRNA和构建进化树鉴定分析，以期为我国生态绿色茶园的建设、茶叶农药降污剂的开发和提升茶叶品质提供参考。

1 材料与方法

1.1培养基

电富集培养基(g/L)：蛋白胨5，酵母提取物5，磷酸氢二钾1，葡萄糖1，pH 7.0-7.2。LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂粉15，pH 7.0-7.2。基础无机盐培养基MSM(g/L)：磷酸氢二纳1.5，磷酸二氢钾1.5，硝酸四氢氮1，硫酸镁0.2，氯化钙0.01，硫酸镁0.001，酵母提取物0.05，pH 7.0-7.2。

分离培养基：在MSM培养基中加入联苯菊酯乳油使培养基中联苯菊酯的终浓度达到实验所需浓度。

1.2实验方法

1.2.1供试土壤的驯化将土壤编号1、2、3、4、5、6的土壤按1:1:1:1:1:1的比例混合，分装到6个花盆里，每天浇灌适量联苯菊酯乳油稀释液，保持土壤湿润，第一个月浇灌的联苯菊酯乳油稀释液浓度为100 mg/L,每个月以50 mg/L的浓度增幅依次递增，浇灌驯化12个月，即为土样驯化。

1.2.2联苯菊酯降解菌系的富集及降解菌株LB-1的分离、纯化富集培养：分别取7号样品污泥和驯化土样5 g到100 mL含联苯菊酯50 mg/L的富集培养基中，30 ℃，170 r/min震荡培养7 d。

驯化培养：吸取富集培养液10 mL转接到100 mL含有100 mg/L的联苯菊酯的MSM培养基中，30 ℃，170 r/min震荡培养7 d。取10 mL培养液接入到浓度为200 mg/L的联苯菊酯的MSM培养基中，培养方法同上，震荡培养7 d，用同样的培养方法，以100 mg/L的浓度增幅依次提高MSM培养基中联苯菊酯的浓度至1000 mg/L。

分离纯化：将最终驯化得到的培养液经过梯度稀释后涂布在含有100 mg/L联苯菊酯的MSM培养基平板上，每个梯度(10-1、10-2、10-3、10-4)涂布三块平板，30 ℃恒温培养3 d。挑取生长旺盛的单菌落进行反复划线纯化，将纯化后的菌株保存在含有15%甘油和100 mg/L联苯菊酯的LB培养基中，编号，于-80 ℃冰箱内保存备用。

LB-1降解菌的筛选：实验共获得4株对联苯菊酯有降解效能的菌株，其中菌株LB-1可在3 d内对50 mg/mL联苯菊酯的降解效能达到92.4%，该部分将另文发表。

1.2.3 菌株的鉴定形态学观察:将分离纯化得到的降解菌采用平板划线法接种到固体LB培养基上，30 ℃培养16 h后观察菌落形态。

生理生化反应:用接种环从平板上挑取已分离的单一菌落分别接种到生化反应安培瓶(北京陆桥技术有限公司)中，置适宜温度下培养，观察反应现象。透射电镜观察,具体如下:

①在液体LB培养基上以30 ℃，180 r/min条件过夜培养降解菌；

②将膜铜网附在菌悬液上1 min，取出，放在滤纸片上自然风干；

③将附有细菌的膜铜网在pH 6.8的2%磷钼酸液滴上染色1-2 min，放在滤纸片上自然风干，于透射电镜下观察。

1.2.4LB-1菌生长曲线分析用接种环取一环经过平板活化的LB-1菌至MSM液体培养基中，在30 ℃，170 r/min的条件下每隔2 h取一次菌液，菌液在600 nm波长下测定其光密度值(OD)，绘制LB-1菌的生长曲线。

1.2.5LB-1菌系统发育分析(1)菌株总DNA的提取:菌株总DNA的提取方法参照南春燕(2013)的方法，具体如下：

①取1 mL菌液，8000 g，离心2 min，弃上清，加400 μL提取缓冲液冲洗细胞2次，8000 g，离心2 min，弃上清。

②用200 mL TE buffer悬浮菌体，加入100 μL的Tris 饱和酚(pH 8.0)，涡旋混合1 min。

③13000 rpm/min，离心5 min，取上清。

④加入40 μL TE buffer和100 μL氯仿，混合震荡，13000 rpm/min，离心5 min。

⑤取160 μL上清液，加入40 μL TE buffer和5 μL RNase(10 mg/mL)，37 ℃放置10 min。

(2)菌株16S rDNA扩增

引物序列：P0：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'； P6：5'-CATCGGCTACCTTGTTACGA-3'

PCR扩增反应体系：细菌总DNA模板(约100ng/μL)1 μL，Taq PCR Mix 12.5 L(2x)12.5 μL，引物 P0(10R Mix 12.5 L(2x)) 1 μL，引物 P6(10R Mix 12.5 L(2x)) 1 μL，去离子水9.5 μL

PCR 反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环30次，最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

PCR产物送往上海生工生物公司测序。

(3)菌株系统发育树的构建

将测序结果序列提交GenBank进行BLAST比对，下载相似度大于95%的模式菌株的序列，以fasta格式整合到一个文件内，启动MEGA 5.0软件，将得到的整合文件导入到MEGA软件，序列全选，用Align by Clustal W进行多重序列比对，比对结束后，选择菜单栏中Analysis选项中的 phylogeny Construct/Test Neighbor Joining Tree选项进行序列数据的统计，然后计算分枝间的遗传距离。Boostrap值设置为1000来分析分支系统发育树各分支聚类的稳定性。

2结果与分析

2.1联苯菊酯降解菌LB-1的形态特征

经过连续12个月的土壤菌株驯化培养，再通过平板划线分离技术，得到一株以联苯菊酯为唯一碳源的菌株，将其命名为LB-1，该菌株菌落光滑，呈白色半透明状，直径2-3 nm。电镜下观察得到，联苯菊酯降解菌LB-1椭圆状杆菌，大小约为2圆状杆无芽孢、鞭毛状结构，有较厚的荚膜(图1)。

图1菌株LB-1电镜图 图2菌株LB-1的16S rDNA电泳图

Figure 1Strain LB-1 by scanning Figure 2Electrophoretogram picture of

electron microscope (SEM) 16S rDNA on strain LB-1

1.LB-1; 2.Mark

2.2联苯菊酯降解菌的鉴定

提取菌株LB-1的总DNA，并进行16S rRNA扩增，电泳得到1400 bp片段(图 2)，将扩增产物送至上海生工测序，测序结果上传至NCBI比对得到，该菌株率属于克雷伯氏菌属，与Klebsiella variicola的序列匹配度达到99.9%。对该菌株进行系统进化树分析得到(图3)，LB-1与6株克雷伯氏菌模式菌株形成3个不同的分支，表明这些菌株属于3个不同的亚群，但与美国变栖克雷伯氏菌KlebsiellavariicolaAt-22亲缘关系最近。因此根据16S rDNA鉴定以及系统进化树分析，联苯菊酯降解株LB-1被鉴定为克雷伯氏菌。

2.3联苯菊酯降解菌LB-1的生理生化特性

联苯菊酯降解菌LB-1为革兰氏阴性菌，其生理生化特性如图4所示，硫化氢反应、硝酸盐反应、NaCl-蛋白胨反应呈阴性，但尿素酶、42 ℃生长反应呈阳性；LB-1菌能利用阿拉伯糖产酸。

图3联苯菊酯降解菌LB-1的系统进化树

Figure 3Phylogenetic tree of bifenthrin-degrading strain LB-1

图4菌株LB-1生理生化鉴定

Figure 4Physiology and biochemistry identification of strain LB-1

2.4菌株LB-1生长曲线

如图5所示，菌株LB-1在发酵培养初期(0-2 h)生长缓慢，主要原因是细菌必须在适应培养环境以及为对数生长期的快速繁殖合成必要的前体物质，在2-16 h培养时间内菌株处于对数生长期，该期间菌株LB-1快速繁殖，菌浓度越来越高；培养16 h之后菌株进入稳定生长期，菌株生长量与死亡量相平衡，菌浓度变化不大；在培养20 h后由于培养液营养物质消耗殆尽以及有害次生代谢产物的积累导致菌株生长量低于死亡量，细菌进入衰亡期。

图5　菌株LB-1生长曲线

3讨论

国内外已有大量有关菊酯类农药降解菌的报道，近几年对联苯菊酯农药降解菌的报道也越来越多(王兆守等，2003)，但截止目前，除绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa(张建云等，2010)外，已报道的菊酯类农药降解菌主要集中在真菌(Saikia and Gopal,2004)、绿色木霉Trichodermaviride(Liang et al.,2005)、曲霉属AspergillusnigerZD11(李松桧和李日强，2008)等。张建云等(2010)报道绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaGZ-3在37 ℃和220 r/min培养条件下培养72 h后对初始浓度为50 mg/L的氟氯氰菊酯的降解效率可达80%以上。T.Viride 5-2, T.Viride 2211,Aspergillusniger,A.terricola, 和Phanerochaetechrysoporium在28 ℃下培养20 d后对初始浓度为5 mg/mL的氟氯氰菊酯的降解效率分别达80%，62%，30%，30%和60%左右。但有关克雷伯氏菌属农药降解菌的报道还没有见到，本实验从农药驯化土壤中分离筛选出一株潜在的降解联苯菊酯的菌株LB-1，通过形态学，生理生化特性，16S rDNA初步鉴定为克雷伯氏菌。菌株LB-1的分离丰富了菊酯类农药降解菌资源，在被污染的土壤和污水等环境的生物修复中具有很大的应用潜力。但降解菌对于农药的降解一般都是通过共代谢或者矿化方式进行。降解过程中产生的次生代谢产物有可能次生代谢物的毒性高于本体而存在环境安全性问题，如Khanetal(1988)分离到一株溴氰菊酯降解菌，降解效果不佳，不能完全彻底降解溴氰菊酯。主要是溴氰菊酯降解会产生另一种对水体等有毒的物质间苯氧基苯甲醛(3-PhenoxyBenzalde-hyde)。因此笔者认为除了加强对原位修复微生物资源的开发和挖掘外，解决菌株室外降解效能与自然环境中恶劣且复杂的生态环境和农药处理负荷存在差距的问题，还要加强对农药降解的中间产物和进一步降解的途径研究，从而更全面对降解菌环境安全性的进行评价，以便更有助于降解菌产业化的应用。

参考文献

陈宗懋.2001.欧盟关于茶叶中农药最高残留限量的一些最新规定.农药科学与管理,1:17.

陈宗懋.2002.无公害茶叶生产中拟除虫菊酯类农药的选择.中国茶叶,3:3-4.

戴平望.2014.超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中5种农药残留量.理化检测,4:508-511.

李松桧,李日强.2008.有机磷农药生物降解的研究进展.科技情报开发与经济,12:123-124.

罗天雄.2009.联苯菊酯降解微生物生长环境的优化作用研究.安徽农学通报,15(21):35,153.

南春燕.2013.杀虫剂降解菌的筛选和鉴定及按蚊肠道宏基因组的组成研究.陕西师范大学硕士学位论文,p.1-76.

乔雄梧.1999.农药在土壤中的环境行为.农药科学与管理,6:12-16.

王伟东,牛俊玲,崔宗均.2005.农药的微生物降解综述.黑龙江八一农垦大学学报,17(2):18-22.

王兆守,林淦,李秀仙,梁小虾,尤民生.2003.拟除虫菊酯降解菌的分离、筛选及鉴定.福建农林大学学报(自然科学版),32 (2):176-180.

王兆守,李顺鹏.2005.拟除虫菊酯类农药微生物降解研究进展.土壤,37(6):577-580.

张建云,崔树军,武秀琴,宋海军.2010.1株氟氯氰菊酯降解菌GZ-3的分离和鉴定.安徽农业科学,38: (13):6635-6636,6640.

Khan,SU,Behki RM,Tapping RI,Humayoun Akhtar M.1988.Deltamethrin residues in an organic soil under laboratory conditions and its degradatin by a bacterial strain.Journal of Agricultural and Food Chemistry,36(3):636-638.

Laskowski DA.2002.Physical and chemical properties of pyrethroids.Reviews of Environmental Contamination and Toxicoligy.New York: Springer,p.49-170.

Lee S, Gan JY,Kabashima JN,Crowley DE.2004.Microbial transformation of pyrethroid insecticides in aqueous and sediment phases.Environmental Toxicology and Chemistry,23:1-6.

Liang WQ,Wang ZY,Li H,Wu PC,Hu M,Luo N,Cao LX,Liu YH.2005.Purification and characterization of a novel pyrethroid hydrolase from Aspergillus niger ZD11.Journal of Agricultural and food chemistry,53 (19): 7415-7420.

Saikia N,Gopal M.2004.Biodegradation of β-Cyfluthrin by Fungi.Journal of agricultural and food chemistry,52 (2): 1220-1223.

Singh BK.2009.Organophosphorus-degrading bacteria: ecology and industrial applications.Nature Reviews Microbiology,7:156-163.

Sogorb MA,Vilanova E.2002.Enzymes involved in the detoxification of organophosphoms,carbamate and pyrethroid insecticides through hydrolysis.Toxicology Letters,128(1-3):215-228.

Yu YL,Chen YX,Luo YM.2003.Rapid degradation of butachlor in wheat rbizosphere soil.Chemosphere,50:771-774.

Zhang WJ,Rui WY,Tu C,Diab HG,Louws FJ,Mueller JP,Creamer N,Bell M,Wagger MG,Hu S.2005.Responses of soil microbial community structure and diversity to agricultural deintensification.Pedosphere,15(4):440-447.

(责任编辑：陈晓雯)

胡桂萍，叶武光，石旭平，张国彪，贺望兴，游艳红，朱运华.2015.茶叶联苯菊酯残留降解菌的筛选与鉴定.武夷科学，31：147-153.

Isolation and identification of degrading bacteria against tea bifenthrin residue

Gui-Ping HU, Wu-Guang YE, Xu-Ping SHI, Guo-Biao ZHANG,

Wang-Xing HE, Ye-Hong YOU, Yun-Hua ZHU

(JiangxiSericultureandTeaResearchInstitute,Nanchang,Jiangxi330202,China)

Abstract:One strain LB-1 was isolated from the soil in tea plantations by bio-enrichment and pesticide acclimatization, for degrading bifenthrin that was often in excess of maximum residue limit (MRL) in tea plantations. Strain LB-1 was identified as Klebsiella sp. using the morphological, physiological and 16S rDNA sequence analysis. The strain LB-1 showed S growth in minimum salts medium (MSM) with strong potential for the degradation of bifenthrin and could provide important sources for the developing safe and green degrader of tea, and also provide theoretical support and technical reference for pesticide degrader of other fruits and vegetables.

Key words:tea plantation; microbial degradation; bifenthrin; Klebsiella sp.

中图分类号:X592; X172

文献标识码:A

文章编号：1001-4276-(2015)01-0147-07

通讯作者：胡桂萍(1985-),女，博士。研究方向：茶叶病虫害和农药残留微生物降解技术。email：hugp2007@163.com。

基金项目：科技支撑计划(20151BBA13042)、公益性行业(农业)科研专项(201303094-08)。

收稿日期：2015-10-12; 发表日期：2015-10-31