双水相法分离螺旋藻藻蓝蛋白与多糖

齐清华， 陈宇熹， 叶　舟

(福建农林大学植物保护学院， 福建 福州 350002)

双水相法分离螺旋藻藻蓝蛋白与多糖

齐清华， 陈宇熹， 叶舟*

(福建农林大学植物保护学院， 福建 福州 350002)

摘要:以螺旋藻为原料，采用PEG2000-硫酸镁双水相体系对螺旋藻粗提液中的藻蓝蛋白和多糖进行分离。分别探讨了PEG2000质量分数、硫酸镁质量分数、离子强度、体系pH及萃取次数对双水相体系萃取藻蓝蛋白与多糖的影响，设计正交试验优化萃取条件，并考察了螺旋藻的反萃取体系条件。结果表明：当硫酸镁质量分数为14%，PEG质量分数为6%，KCl质量分数为0.5%，体系为pH4.0时，为优化双水相萃取体系。螺旋藻水提液通过双水相萃取，藻蓝蛋白富集于上相，萃取率为93.91%；下相中糖类萃取率为59.58%。收集上相，采用12%PEG，6%硫酸镁的双水相体系对藻蓝蛋白进行反萃取，藻蓝蛋白反萃取率为99.06%。螺旋藻水提液经过PEG2000-硫酸镁双水相体系萃取与反萃取，藻蓝蛋白回收率达92.66%，藻蓝蛋白纯度由0.78提高到2.64。

关键词:双水相萃取； 藻蓝蛋白； 多糖

螺旋藻具有很高的营养价值，含有高达50%-75%的蛋白质，多种维生素，必需氨基酸，必需脂肪酸和矿物质等；此外，螺旋藻中还含有多糖(polysaccharides of spirulina platensis， PSP)、藻蓝蛋白(C-phycocyanin , CPC)、γ-亚麻酸等生理活性物质，因此越来越多地被开发为功能性食品、保健品等(Belayetal.， 1993； Capellietal.， 2010； 张鹏， 2011； 张文， 2013)。在众多活性物质中，热点研究的对象为多糖与藻蓝蛋白。螺旋藻多糖是一类具有天然生物活性的物质，具有增强免疫力、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤和降血糖等功能(韦金河， 2009； 陈雷， 2011； 徐小娟， 2012； Paragesetal.， 2012； Chaiklahanetal.， 2013)。藻蓝蛋白是一种光合色素，其水溶液为亮蓝色，可作为天然色素应用于食品、化妆品等工业，高纯度藻蓝蛋白可被开发为荧光剂，应用于生物学、化学和细胞学等，具有更高的经济价值。此外，藻蓝蛋白还具有诸多生理活性功能，如提高免疫力、抗癌、抗氧化等功能(张成武， 1996； 李冰， 2009； 孙国艳， 2010)。

双水相萃取技术具有条件温和、易于放大和控制等优点，适用于生物物质的分离和纯化。Patiletal.(2007)研究了聚乙二醇分子量、聚乙二醇与盐的质量分数、pH值等对双水相体系萃取藻蓝蛋白的影响，发现与两种聚合物形成的双水相体系相比，聚合物-盐双水相体系效果更好。本文探讨采用双水相萃取方法分离螺旋藻中多糖与藻蓝蛋白，并对藻蓝蛋白进行了纯化。

1材料与方法

1.1材料与试剂

螺旋藻干粉(鲜藻由福建省神六保健食品有限公司提供，冷冻真空干燥处理后于-20 ℃避光保存)；聚乙二醇2000，硫酸镁，氯化钠，氯化钾等试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

CF15RXⅡ型离心机(日本HITACHI公司)，UV-1801紫外/可见光分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)，pH计，漩涡振荡器。

1.3实验方法

1.3.1螺旋藻水提液的制备称取1 g藻粉，加入100 mL水溶胀后4次反复冻融破壁(-20 ℃冷冻，室温融化)，5000 r/min(4℃)离心15 min，取上清液定容至100 mL得螺旋藻水提液，测得藻蓝蛋白纯度(A620/A280)为0.78，贮存于4 ℃备用。

1.3.2PEG2000-硫酸镁双水相图的制作 取三支试管，分别称取0.500 g PEG2000于试管中，加入0.5 mL去离子水，用胶头滴管缓慢滴加质量分数为23%的硫酸镁溶液，边滴加边摇匀，直到溶液开始出现浑浊为止，记录此时的溶液质量，计算PEG2000和硫酸镁的在体系中质量分数；然后再添加0.5 mL去离子水，重复以上步骤，记录和计算数据，取三管平均值。以PEG2000质量分数(%)为纵坐标，硫酸镁质量分数(%)为横坐标绘制曲线。

1.3.3双水相体系的配制取15 mL离心管，称不同质量分数的PEG2000、硫酸镁、中性盐，加入2 mL螺旋藻水提液，加水至总质量为10 g，充分混匀后静置3 h分相。

1.3.4计算方法藻蓝蛋白在620 nm处有特征吸收峰，蛋白质在280 nm处有特征吸收峰，因此藻蓝蛋白的纯度用A620/A280表示(Bennettetal.，2007)。藻蓝蛋白浓度(CCPC)、相比(R)、分配系数(P)计算公式如下：

式中：A280、A620、A650分别为样品液在波长280nm、620nm、650nm处吸光度值。

多糖浓度测定采用苯酚硫酸法，以葡萄糖为标准品，标准曲线为A=0.0130C+0.0117(R2=0.9997)，其中C为多糖浓度(μg/ml), A为490nm处吸光度值。

2结果与分析

2.1PEG2000-硫酸镁双水相图

PEG2000-硫酸镁双水相相图见图1，根据双节线图选择合适的PEG与硫酸镁质量分数范围进行探讨。

图1　PEG2000-硫酸镁双水相相图

2.2PEG2000质量分数对双水相体系的影响

当硫酸镁质量分数为15%时，梯度调节PEG2000质量分数。结果表明，当硫酸镁质量分数为15%， PEG质量分数为5%-15%时，体系分相完全；当PEG质量分数为20%时，藻蓝蛋白在PEG相中发生了严重沉降；当PEG质量分数达到25%时不能分相；因此选择6%-18%质量分数的PEG质量分数进一步探讨，结果见表1。

当硫酸镁质量分数一定时，在一定范围内随着PEG质量分数的增加，相比逐渐升高，藻蓝蛋白的分配系数先降低后升高，多糖分配系数逐渐降低，藻蓝蛋白的纯度呈降低趋势，上相中藻蓝蛋白的萃取率逐渐增加，下相中多糖的萃取率先降低后升高。

表1　PEG2000质量分数对多糖及藻蓝蛋白萃取的影响

2.3硫酸镁质量分数对双水相体系的影响

当PEG2000质量分数为10%时，调节硫酸镁质量分数，考察对双水相形成及藻蓝蛋白萃取的影响。当PEG2000质量分数为10%，硫酸镁质量分数为10%-20%时，体系能够分相完全；当硫酸镁质量分数增加到25%时，硫酸镁不能完全溶解，因此选择10%-20%质量分数的硫酸镁质量分数进一步探讨。

由表2可以得出，当PEG质量分数一定时，随着硫酸镁质量分数的增加，相比逐渐降低，藻蓝蛋白的分配系数、藻蓝蛋白的纯度以及上相中藻蓝蛋白的萃取率和下相中多糖的萃取率都呈先升高后降低趋势。当PEG质量分数为10%，硫酸镁质量分数为16%时，上相中藻蓝蛋白纯度、得率以及下相中多糖萃取率都达到最大。

表2　硫酸镁质量分数对藻蓝蛋白萃取的影响

2.4离子强度对双水相体系的影响

双水相体系的上下相间存在电位差，通过加入不同种类和浓度的盐可以使体系的电荷状态和疏水作用发生改变，进而对物质在两相中的分配产生影响(Patiletal.， 2007)。配制PEG2000质量分数10%、硫酸镁质量分数16%的体系，考察不同浓度NaCl和KCl两种盐对藻蓝蛋白萃取的影响，结果见表3。

由表3可知，随着NaCl和KCl浓度的升高，上相中藻蓝蛋白纯度与萃取率都先升高后降低；比较两种盐发现添加KCl效果更佳。当PEG2000质量分数10%、硫酸镁质量分数16%时，与未添加KCl的体系相比，添加质量分数为1.0%的KCl情况下，上相中藻蓝蛋白纯度与萃取率都较高，但是当KCl质量分数为大于2.0%时，藻蓝蛋白的纯度与萃取率反而降低。因此选择KCl质量分数为0，0.5%，1.0%，1.5%进一步研究。

表3　离子强度对藻蓝蛋白萃取的影响

2.5pH值对双水相体系的影响

双水相体系pH值变化能改变两相的电位，并影响蛋白质带电性质，从而影响蛋白在两相中的分配(郑楠， 2006)。配制硫酸镁质量分数为16%，PEG质量分数为10%的双水相体系，体系初始pH为4.2-4.3。由于藻蓝蛋白较稳定的pH范围为4.5-8.5(张以芳， 1999)，因此调节体系pH分别为4.0，5.0，6.0，7.0和8.0，考察pH对藻蓝蛋白在双水相体系中的影响，结果见图2。

图2表明，随着双水相体系pH的升高，上相中藻蓝蛋白的纯度与萃取率都呈降低趋势。而体系初始pH约4.3，因此在后面的研究中不对体系pH进行调节。

图2　pH值对双水相萃取藻蓝蛋白的影响

2.6正交试验

综合单因素实验结果，设计L16(34)正交试验考察硫酸镁质量分数、PEG2000质量分数以及KCl质量分数对双水相萃取多糖与藻蓝蛋白的影响，结果与分析见表4与表5。

综合考虑上相中藻蓝蛋白纯度与萃取率，下相中多糖萃取率，硫酸镁质量分数14%，PEG2000质量分数为6%，KCl质量分数为0.5%时为优化体系。螺旋藻水提液通过此双水相体系萃取，下相中多糖萃取率为59.58%，藻蓝蛋白富集于上相，萃取率为93.91%，藻蓝蛋白纯度由0.78提高到1.95。

2.7双水相萃取与反萃取藻蓝蛋白

双水相萃取与反萃取藻蓝蛋白螺旋藻水提液经PEG2000-硫酸镁双水相优化体系萃取后收集上相，加入适量硫酸镁与水反萃取藻蓝蛋白。结果表明，藻蓝蛋白的较佳反萃取体系为PEG质量分数12%，硫酸镁质量分数6%，藻蓝蛋白反萃取率为99.06%。螺旋藻水提液经过PEG2000-硫酸镁双水相体系萃取与反萃取，藻蓝蛋白回收率达92.66%，藻蓝蛋白纯度由1.95提高到2.64。

表4　双水相萃取正交试验结果

注：A为硫酸镁质量分数，B为PEG2000质量分数，C为KCl质量分数

表5　双水相萃取正交试验结果分析

注：表中k1、k2、k3表示各因素不同水平下CPC纯度、CPC萃取率或多糖萃取率的平均值，R表示极差分析；其中A为硫酸镁质量分数，B为PEG2000质量分数，C为KCl质量分数

3讨论

本研究分别考察了PEG2000质量分数、硫酸镁质量分数、离子强度和体系pH值在PEG-硫酸镁双水相体系中对螺旋藻藻蓝蛋白和多糖萃取的影响，体系中上相为PEG相，下相为盐相。当硫酸镁质量分数一定时，随着PEG质量分数在一定范围内的增加，有利于藻蓝蛋白在上相中富集，多糖更多存在于下相中；但是随着PEG质量分数进一步增大，可能更多的杂蛋白进入上相，使上相中藻蓝蛋白的纯度降低。当PEG质量分数一定时，随着硫酸镁质量分数在一定范围内的提高，双水相体系逐渐远离临界点，物质在两相中界面张力增大，有利于藻蓝蛋白在上相富集，多糖在下相富集；当硫酸镁质量分数更大时，上相体积逐渐减小，同时粘度逐渐增大，不利于藻蓝蛋白在上相的富集。综合双水相萃取单因素试验和正交试验结果，藻蓝蛋白萃取率达到93.91%；多糖萃取率为59.58%。

双水相体系分相后，藻蓝蛋白富集于PEG相中，同时体系中少量硫酸镁、PEG会分别存在于PEG相和硫酸镁相中，因此需要在萃取试验的基础上进行反萃取，使藻蓝蛋白进入下相，以利于藻蓝蛋白的后续回收利用。通过反萃取试验，大大提高了藻蓝蛋白的纯度，纯度由0.78提高到2.64。双水相萃取条件温和，工艺简便，易扩大，适合于工业应用，本试验为进一步研究螺旋藻藻蓝蛋白和多糖的双水相萃取工艺条件具有一定的指导意义。

参考文献

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(责任编辑：陈晓雯)

齐清华，陈宇熹，叶舟.2015.双水相法分离螺旋藻藻蓝蛋白与多糖.武夷科学，31：154-160.

The extraction of C-phycocyanin and polysaccharides fromSpirulina

using aqueous two-phase system

Qing-Hua QI, Yu-Xi CHEN, Zhou YE*

(CollegeofPlantProtection,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

Abstract:PEG2000-MgSO4aqueous two-phase extraction (ATPE) was used to isolate C-phycocyanin and polysaccharides from crude extract of Spirulina. The influence of various process parameters on the isolation and purification of C-phycocyanin and polysaccharides was studied, such as mass fraction of PEG2000, magnesium sulfate, neutral salts and system pH, and the orthogonal experiment was designed to optimize conditions. The reverse extraction of phycocyanin was also studied. The results showed that the optimal ATPE conditions were 14% MgSO4, 6% PEG2000, 0.5% KCl, system pH 4.0. After the optimal ATPE, the yield of CPC was 93.91% from the top phase, and saccharides yield were 59.58% from the bottom phase. The optimal reverse extraction condition of CPC was 12% PEG2000, 6% MgSO4. After extraction and reverse extraction, 92.66% of CPC was obtained. Meanwhile, the purity of CPC was increased to 2.64 from initial 0.78.

Key words:aqueous two-phase extraction (ATPE); polysaccharide; phycocyanin

中图分类号:Q946

文献标识码:A

文章编号：1001-4276-(2015)01-0154-07

作者简介:齐清华(1989-)，女，硕士研究生。研究方向：天然药物。Email：542220350@qq.com。*通信作者叶舟( 1957-)，男，教授。研究方向：天然药物。Email: yezhou1182@126.com。

基金项目:福建省高校产学合作科技重大项目(2013N5001)、福建省自然科学 (2011J01077)资助。

收稿日期：2015-03-03; 发表日期：2015-10-31