响应面法优化微波辅助提取苹果皮中总黄酮的工艺研究

张晓静，龚婷，扶庆权，潘春梅

(1.河南牧业经济学院生物工程系，河南 郑州　450046；2.河南牧业经济学院学生处，河南 郑州　450046；

3.南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏 南京　211171)



响应面法优化微波辅助提取苹果皮中总黄酮的工艺研究

张晓静1，龚婷2，扶庆权3，潘春梅1

(1.河南牧业经济学院生物工程系，河南 郑州450046；2.河南牧业经济学院学生处，河南 郑州450046；

3.南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏 南京211171)

摘要：以果汁厂副产物苹果皮为原料，考察乙醇体积分数、微波温度、微波时间和料液比对苹果皮总黄酮得率的影响，在此单因素试验的基础上，运用Box-Behnken试验设计和响应面分析法进行回归分析，优化微波提取总黄酮的最佳工艺条件.结果表明：乙醇体积分数、微波温度、微波时间与总黄酮得率存在显著的相关性，回归模型拟合显著，可对苹果皮总黄酮得率进行预测和分析；微波辅助提取苹果皮中总黄酮的最佳工艺条件是：微波温度50 ℃，乙醇体积分数70%，微波时间3 min，料液比1∶50 (g∶mL).在此试验条件下，苹果皮中总黄酮得率为3.37%，与优化前相比总黄酮得率提高了7%.

关键词：苹果皮； 黄酮； 微波辅助； 响应面法

第一作者：张晓静(1976-)，女，硕士，讲师，研究方向为活性物质提取及食品添加剂应用.E-mail:zhangxj228@163.com

苹果为蔷薇科苹果属多年生落叶乔木，在我国华北、东北、西北等地广泛栽培，是我国面积最大、产量最多的水果品种[1-2].随着我国中西部地区苹果汁加工业的迅猛发展，每年会产生约10～15万吨苹果皮等副产物[3].苹果皮中富含黄酮类化合物等多种生物活性物质，黄酮类化合物具有清除氧自由基、抗癌抗肿瘤、防治心血管疾病、抗氧化抗衰老、抑菌抗病毒、调节免疫、增强机体免疫功能、调节内分泌系统等多种生理功能[4-6].但是，目前绝大多数的苹果皮没有得到有效的利用而被废弃，如能将苹果皮中的黄酮类物质进行高效提取，既能增加苹果产业的附加值，又能减少资源浪费和环境污染.

迄今为止，有关苹果皮中黄酮类物质提取的研究少有报道，提取工艺仅局限于有机溶剂提取法和超声辅助提取法.薛蒙伟等[7]利用有机溶剂回流提取苹果皮总黄酮，在乙醇体积分数65%，提取温度45 ℃，料液比1∶45(g∶mL)、提取时间210 min的条件下，总黄酮得率达到3.52%，焦岩等[8]采用超声波辅助法对苹果皮中的总黄酮进行提取，在乙醇体积分数50.3%，液固比28.9∶1，时间49.1 min的最佳条件下，总黄酮得率为19.32 mg/g.传统有机溶剂提取法提取率较高，但提取时间长，超声提取法耗时较短，但提取收率相对较低，这2种方法都有较大的局限性.

微波辅助法是提取植物有效成分常用的一种手段，具有操作简单，节省时间和试剂，加热效率高，穿透力强，选择性好，提取率高及产物纯度高等诸多优势[9-10].微波辅助提取苹果皮总黄酮尚未见报道，鉴于此，本研究采用微波辅助法从苹果皮中提取黄酮类化合物，运用响应面法探讨其提取工艺的最优条件，开发一种经济可行、提取率高的苹果皮黄酮类化合物的提取工艺，为苹果价值的全面开发提供科学的依据.

1材料与方法

1.1材料和试剂

苹果皮，由河南灵宝某果汁有限公司提供，将皮晒干粉碎后备用.

芦丁标准品，中国食品药品检定研究院；亚硝酸钠、无水乙醇、氢氧化铝，南京化学试剂有限公司，分析纯；硝酸铝，上海中试化工总公司，分析纯；氢氧化钠，天津永大化学试剂有限公司，分析纯.

1.2试验设备

微波快速制样仪(上海新仪微波化学科技有限公司)；AUY120型电子天平(日本岛津公司)；7230G可见分光光度计(上海精密科学有限公司)；GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；TDL-4型台式离心机(上海安亭科学仪器厂).

1.3试验方法

1.3.1样品液的制备取粉碎的苹果皮粉1.000 0 g置于微波用三口烧瓶中，按照试验设计的料液比加入一定体积分数乙醇溶液后，在一定温度下微波提取一定时间.提取完毕后趁热抽滤，所得滤液离心，取上清液待测.

1.3.2样品液中总黄酮含量的测定量取2 mL样品液于25 mL容量瓶中，移取70%乙醇溶液10 mL，先加入5%亚硝酸钠溶液1.00 mL，摇匀，静置6 min；再加入10%硝酸铝溶液1.00 mL，摇匀，静置6 min；最后加入4%NaOH溶液5.00 mL，摇匀后用70%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15 min[11-13].用空白液作参比，此溶液于510 nm处测定吸光度，查芦丁标准曲线计算样品液中总黄酮含量.

1.3.3芦丁标准曲线的制作精密称取于105 ℃条件下干燥至恒质量的芦丁标准品100 mg，用70%乙醇溶液溶解并定容，配制成0.1 mg/mL的芦丁标准液，备用.分别准确吸取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL的芦丁标准液于25 mL容量瓶中，按照1.3.2试验方法测定510 nm处的吸光度.根据所得数据，制作出描述芦丁浓度C与吸光度A关系的标准曲线.其线性回归方程为：A=7.873 7C+0.000 9，R2=0.999 2.

1.3.4总黄酮得率的计算总黄酮得率按下式计算：

式中：c为样品液中总黄酮质量浓度(mg/mL)；v为样品提取液的体积(mL)；n为稀释倍数；m为苹果皮粉的质量(g).

1.3.5单因素试验设计以乙醇溶液为提取试剂，固定乙醇体积分数70%、提取温度60 ℃、提取时间5 min、料液比1∶40，分别考察不同的乙醇体积分数、微波温度、微波时间和料液比进行单因素试验.按照1.3.2试验方法测定总黄酮含量，计算得率，研究上述四项因素对苹果皮总黄酮得率的影响.

1.3.6响应面优化试验设计及数据分析本研究采用Box-Behnken设计对总黄酮提取工艺条件进行四因素三水平的响应面分析试验，以获得最佳提取条件.以微波温度(A)、乙醇体积分数(B)、料液比(C)和微波时间(D)为自变量，试验设计见表1.采用Design Expert 8.0软件对响应面试验数据进行线性回归和方差分析，通过考察F值(P<0.05)确定模型及因素的显著性，并根据响应曲面图及等高线图分析出各因素间交互作用的显著性，以得出科学的实验结果与分析[14-15].

表1　响应面Box-Behnken设计试验因素与水平

2结果与讨论

2.1单因素试验结果

2.1.1乙醇体积分数对苹果皮中总黄酮得率的影响图1显示的是料液比1∶40，60 ℃条件下微波处理5 min，不同乙醇体积分数对苹果皮总黄酮得率的影响.由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮得率随之提高，当乙醇体积分数升至70%时，总黄酮得率达到峰值，之后随着乙醇体积分数再增加，总黄酮得率反而下降.这可能是因为当乙醇溶液体积分数过高时，其溶液沸点降低(乙醇沸点79 ℃)，导致挥发性过大，同时一些醇溶性的其他物质大量溶出，从而导致黄酮类物质的得率降低[7,11].因此，确定乙醇体积分数70%作为最佳提取浓度.

图1　乙醇体积分数对总黄酮得率的影响Fig.1　Effects of concentration of ethanol onextraction ratio of total flavonoid

2.1.2微波温度对苹果皮中总黄酮得率的影响图2显示的是苹果皮粉中按照料液比1∶40加入70%乙醇溶液，微波处理5 min条件下，不同的微波温度对苹果皮总黄酮得率的影响.由图2可知，当微波温度在30～50 ℃之间时，总黄酮得率随着微波温度的升高不断提高.当超过50 ℃后，伴随着微波温度的继续上升，总黄酮得率匀速下降，这可能是由于温度过高，使得黄酮类物质的结构被破坏导致得率下降，故确定50 ℃作为最佳微波提取温度.

图2　微波温度对总黄酮得率的影响Fig.2　Effects of microwave temperature onextraction ratio of total flavonoid

2.1.3微波时间对苹果皮中总黄酮得率的影响图3显示的是苹果皮粉中按照料液比1∶40加入70%乙醇溶液，60 ℃微波处理，不同的微波时间对苹果皮总黄酮得率的影响.由图3可知，随着微波时间的延长，总黄酮得率随之提高，当微波时间为3 min时，总黄酮得率达到峰值，随着微波时间继续延长，总黄酮得率开始缓慢下降.分析得率下降的原因可能是：微波时间过长导致黄酮类物质分解；长时间微波造成乙醇损失量增加，使得提取能力下降.因此，确定出3 min作为最佳微波提取时间.

图3　微波时间对总黄酮得率的影响Fig.3　Effects of microwave time on extractionratio of total flavonoid

2.1.4料液比对苹果皮中总黄酮得率的影响图4显示的是苹果皮粉中加入70%乙醇溶液，60 ℃微波处理5 min，不同的料液比对苹果皮总黄酮得率的影响.由图4可知，随着料液比的增大，总黄酮得率不断提高，当料液比1∶50时，总黄酮得率达到峰值，随着料液比继续增加，总黄酮得率则呈现下降趋势，故确定1∶50作为最佳提取料液比.

图4　料液比对总黄酮得率的影响Fig.4　Effects of solid-liquid ratio on extractionratio of total flavonoid

2.2响应面法优化试验

2.2.1二次响应面回归模型的建立与分析 响应面试验设计与结果见表2.

通过Design Expert 8.0软件进行多元回归拟合分析，得到提取因素与总黄酮得率之间的二次多项式模型为：

Y=3.32+0.15A-0.086B+0.038C-0.066D+0.083AB+0.13AC+0.022AD+0.14BC-0.065BD+0.030CD-0.31A2-0.32B2-0.15C2-0.23D2

式中：Y为苹果皮粉总黄酮得率的预测值；A、B、C、D分别代表微波温度、乙醇体积分数、料液比、微波时间的编码值.

F检验反映回归模型的有效性，包括回归方程显著性检验和失拟性检验.方差分析结果如表3所示，该模型F值=34.84，P<0.000 1，说明该模型具有高度的显著性；该模型失拟性P=0.158 8差异不显著，R2=0.972 1，Radj2=0.944 2，Adeq Precision=21.56，表明该模型拟合效果理想.因此，本模型可适用于预测总黄酮得率.

表2　响应面法试验设计与结果

由表3可以看出，因素A、B、D、AC、BC、A2、B2、C2、D2对苹果皮总黄酮得率有极显著的影响(P<0.01)；因素AB对总黄酮得率有显著影响(0.010.05).由F值可知，对苹果皮总黄酮得率的影响因素依次为：A微波温度>B乙醇体积分数>D微波时间>C料液比.

通过响应曲面对苹果皮中总黄酮得率的解析，得出最佳的提取条件是：微波温度为51.37 ℃，乙醇体积分数为69.78%，微波时间为2.94 min，料液比1∶51.04 (g∶mL).此条件下，苹果皮中总黄酮得率预测值可达3.35%.

表3　响应曲面二次多项式模型的方差分析

*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01).

2.2.2两因素间交互作用的分析模型的响应面立体分析图及相应等高线，见图5～10.各图显示微波温度、乙醇体积分数、料液比、微波时间中任意2个变量保持在最佳条件时，其余2个变量对苹果皮总黄酮得率的影响.

2.2.2.1微波温度和乙醇体积分数的交互作用图5显示的是料液比为1∶51.04(g∶mL)，微波时间2.94 min时，微波温度和乙醇体积分数的交互作用对总黄酮得率的影响.从等高线图和3D曲面图可明显发现，等高线圈为椭圆形，其交互作用显著；当乙醇体积分数一定时，随着微波温度的升高，总黄酮得率呈现先增加后减少的趋势；当固定微波温度不变时，随着乙醇体积分数提高，总黄酮得率也呈现先增加后减少的趋势.提取率在温度48～54 ℃，乙醇体积分数66%～73%的区间内较突出，在上述范围之外提取率明显下降.

微波温度和乙醇体积分数交互作用显著的原因可能是：由于乙醇沸点较低，温度变化对其影响显著.温度不断升高时，乙醇挥发加剧伴随吸热过程造成提取温度不稳定，同时使得体系中的实际乙醇浓度也未达到试验值，从而影响提取率.温度过低时，黄酮类物质分子运动较慢也不利于提取.

2.2.2.2微波温度和料液比的交互作用图6显示的是乙醇体积分数69.78%、微波时间2.94 min时，微波温度和料液比的交互作用对总黄酮得率的影响.从等高线图和3D曲面图可以发现，等高线圈为椭圆形，其交互作用极显著.当料液比一定时，随着微波温度的升高，总黄酮得率呈现先增加后减少的趋势；当固定微波温度不变时，随着料液比的增大，总黄酮得率也呈现先增加后减少的趋势.当微波温度在47～55 ℃，料液比在1∶45～1∶55(g∶mL)这一区间内，提取率较高；在此范围之外，提取率明显下降.

由3D曲面图走势可以看出，高收率区域正向着微波温度和料液比共同增加的方向偏移形成椭圆；微波温度和料液比低时，收率较低.其可能的原因如下.首先，温度过低时黄酮类物质分子运动不强；其次，料液比过低时提取液体积小，黄酮类物质溶出不充分.因此，低温、小料液比区域的得率较低.

2.2.2.3微波温度与微波时间的交互作用图7显示的是乙醇体积分数69.78%、料液比为1∶51.04 (g∶mL)时，微波温度和微波时间的交互作用对总黄酮得率的影响.从图7可发现，等高线圈趋于圆形，3D曲面图中顶端凸面较为均匀圆润，其交互作用不显著.当微波温度在48～54 ℃、微波时间在2.5～3.3 min范围内，提取率维持在一个较高的水平.在这个范围之外的提取率则明显下降.

2.2.2.4乙醇体积分数和料液比的交互作用图8显示的是微波温度51.37 ℃、微波时间2.94 min时，乙醇体积分数和料液比的交互作用对总黄酮得率的影响.由图8可以看出，等高线圈为椭圆形，其交互作用极显著；当料液比一定时，随着乙醇体积分数的提高，总黄酮得率呈现先增加后减少的趋势；当固定乙醇体积分数不变时，随着料液比的增大，总黄酮得率也呈现先增加后减少的趋势.提取率在乙醇体积分数66%～73%，料液比1∶46(g∶mL)～1∶55(g∶mL)区域内稳定在一个较高的数值上.在此范围之外，提取率明显下降.

图5　微波温度和乙醇浓度的交互作用对总黄酮得率的影响Fig.5　Effects of the interaction of microwave temperature and concentration of ethanol on extraction ratio of total flavonoid

图6　微波温度和料液比的交互作用对总黄酮得率的影响Fig.6　Effects of the interaction of microwave temperature and solid/liquid ratio on extraction ratio of total flavonoid

图7　微波温度和微波时间的交互作用对总黄酮得率的影响Fig.7　Effects of the interaction of microwave temperature and microwave time on extraction ratio of total flavonoid

图8　乙醇体积分数和料液比的交互作用对总黄酮得率的影响Fig.8　Effects of the interaction of concentration of ethanol and solid/liquid ratio on extractionratio of total flavonoid

图9　乙醇体积分数和微波时间的交互作用对总黄酮得率的影响Fig.9　Effects of the interaction of concentration of ethanol and microwave time on extraction ratio of total flavonoid

图10　料液比和微波时间的交互作用对总黄酮得率的影响Fig.10　Effects of the interaction of solid/liquid ratio and microwave time on extraction ratio of total flavonoid

由3D曲面图走势可以看出，高收率区域正向着乙醇体积分数和料液比共同增加的方向偏移形成椭圆.乙醇体积分数的增高使得乙醇的挥发量增加，导致整个体系发生两方面的变化，一是乙醇体积分数和料液比并未达到试验值，实际值接近单因素试验峰值，二是乙醇挥发过程中吸收大量热，使得整个体系的温度保持在一个较为温和的状态之下.上述两种可能性改变了因料液比增加导致的黄酮类物质损失量增加而使得提取率下降的趋势，形成一个总黄酮得率的动态平衡，最终使得此交互作用极显著.

2.2.2.5乙醇体积分数和微波时间的交互作用图9显示的是微波温度51.37 ℃、料液比为1∶51.04(g∶mL)时，乙醇体积分数和微波时间的交互作用对总黄酮得率的影响.从图9可发现，等高线圈趋于圆形，3D曲面图中顶端凸面较为均匀圆润，其交互作用不显著.当乙醇体积分数在66%～73%，微波时间介于2.5～3.3 min之间时，提取率维持在一个较高的水平.在此范围之外提取率都大幅降低.

2.2.2.6料液比和微波时间的交互作用图10显示的是微波温度51.37 ℃、乙醇体积分数69.78%时，料液比和微波时间的交互作用对总黄酮得率的影响.从图10可发现，等高线圈趋于圆形，3D曲面图中顶端凸面较为均匀圆润，其交互作用不显著.当料液比在1∶46(g∶mL)～1∶55(g∶mL)之间，微波时间介于2.5～3.3 min之间时，提取率维持在一个较高的水平.在此范围之外，提取率都大幅降低.

2.3模型的验证性试验

为了检验此方法的可靠性，根据实际的操作条件，将苹果皮中总黄酮提取的最佳条件修正为：微波温度50 ℃，乙醇体积分数70%，微波时间3 min，料液比1∶50(g∶mL)，实际测定总黄酮得率为3.37%，与响应面模型预测值3.35%相比，其相对误差为0.597%.表明建立的模型与实际情况基本吻合，将响应面法应用于苹果皮中总黄酮提取工艺的优化准确可靠，具有一定的应用价值.

优化前，微波温度60 ℃，乙醇体积分数70%，微波时间5 min，料液比1∶40(g∶mL)条件下，总黄酮得率最高为3.15%.优化后，处理时间缩短40%，总黄酮得率提高了7%.

3结论

通过单因素试验和响应面法优化微波辅助法提取苹果皮总黄酮的最佳工艺条件为：微波温度50 ℃，乙醇体积分数70%，微波时间3 min，料液比1∶50(g∶mL)，在最佳提取条件下经试验验证，总黄酮得率达到3.37%，与响应面模型预测值3.35%相比，其相对误差为0.597%.

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(责任编辑李辛)

Technology of flavone from apple pericarp with microwave-

assisted extraction optimized by response surface method

ZHANG Xiao-jing1，GONG Ting2，FU Qing-quan3，PAN Chun-mei1

(1.Department of Biotechnology,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China;

2.Students Affairs,Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou 450046,China;

3.School of Biochemical and Environmental Engineering,Nanjing

Xiaozhuang College，Nanjing 211171,China)

Abstract：Apple pericarp from juicing is used as raw material to study the effects of volume fraction of ethanol,microwave temperature,microwave time and solvent/material ratio on extraction of total flavone.Based on above single-factor experiment,Box-Behnken experiment was designed and regression analysis applying response surface method to optimize technical condition by microwave-assisted ethanol extraction of flavones from apple pericarp.The results indicated that concentration of ethanol,microwave temperature and microwave time all significantly correlated to the extraction rate of flavones,regression model fitting was significant,which could be used to predict and analyze the extraction rate of total flavonoid.The optimum technological conditions were microwave temperature 50 ℃,concentration of ethanol 70%,microwave time 3 minutes and solvent/material ratio 1∶50(g∶mL).Under the conditions,the average extraction rate of total flavonoid reaches 3.37%,increased by 7% compared with previous extraction technology.

Key words：apple pericarp;flavone;microwave-assisted;response surface method

收稿日期：2014-12-15；修回日期：2015-04-15

基金项目：河南省科技发展计划项目(122102110130)；河南牧业经济学院科技创新团队项目.

通信作者：潘春梅，女，博士，教授，主要从事发酵工程的研究与教学工作.E-mail:pancm7570@163.com

中图分类号：TS 255.1

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)06-0148-08