血管性痴呆大鼠海马p38MAPK蛋白表达及使用普罗布考的研究

叶海波， 李仁云， 熊章津

(湖北省十堰市太和医院/湖北医药学院附属医院， 湖北 十堰 442000)

血管性痴呆是由多种血管因素所引发的一种综合 性病症，严重损害脑组织同时可伴有认知功能障碍，是老年性痴呆中的主要类别之一［1］。有研究发现在血管性痴呆的发病进程中脑海马神经元凋亡起着直接作用，在脑缺血组织中，p38MAPK可以经细胞凋亡的过程参与到脑组织的损伤［2］。普罗布考有较好的抗氧化及调血脂作用，同时其对炎性因子基因的表达有很好的抑制作用，更能够抑制自由基所介导的炎性反应。本文分析了普罗布考对血管性痴呆大鼠行为学的影响，并观察海马p38 MAPK表达变化，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料:选取63只3月龄雄性大鼠，平均体重(250±10)g，对63只大鼠进行适应性喂养1周后依照随机数字表格法分成三组，分别为普罗布考组、假手术组以及模型组，每组21只。

1.2 所选试剂及药物:普罗布考(齐鲁制药有限公司，国药准字 H10980054);选择美国(Santa Cruz)pp38MAPK兔抗大鼠多克隆抗体以及过氧化物酶标记羊抗兔IgG;上海研晶生物科技有限公司β－Tubulin;武汉博士德公司免疫荧光检测试剂盒(SABC－FITC);购自美国Roche公司原位细胞凋亡检测试剂盒等。

1.3 实验方法

1.3.1 建模及药物治疗:普罗布考组与模型组大鼠应用双侧颈总动脉永久结扎方法建立血管性痴呆模型，假手术组在将双侧颈总动脉分离后不予以结扎，术后逐层缝合皮肤，在术中与术后注意大鼠保暖，结束后将大鼠送回动物房。在手术1周后普罗布考组大鼠予以500mg/kg普罗布考液(溶于500mL浓度0.5%羧甲基纤维素钠中)灌胃，1次/d;假手术组与模型组则予以2mL生理盐水灌胃，1次/d。共8周。

1.3.2 水迷宫实验法:选择中科院药物研究所研发的Morris水迷宫(DMS－2型)，分别测验三组大鼠的行为学变化。每组分别取8只大鼠进行水迷宫隐蔽平台实验3d，测定大鼠的学习能力，详细记录大鼠的逃避潜伏期，之后撤除平台，观察三组大鼠在原平台象限停留时间，测定大鼠的空间探索能力(记忆力)。

1.3.3 测定海马区p38MAPK蛋白表达:三组每组各取6只大鼠，分别在行麻醉处理后断头，取出大鼠脑组织并分离海马组织，匀浆并离心提取其蛋白行蛋白质定量分析，取其中50μg作为样本，将其加注于10%浓度的丙烯酰胺胶约4%的成层胶上，行30mA电泳，时间为2h，温度为室温下，再将胶于4℃下转化为醋酸纤维膜，过夜处理后将该膜与p－p38MAPK兔抗大鼠多克隆抗体在4℃下孵育约2h后再将其与过氧化物酶标记的羊抗兔IgG于室温下进行反应，最后与ECL反应后将膜曝光并显色处理。

1.3.4 TUNEL法测定细胞凋亡情况:三组各选大鼠6只作为测定对象，麻醉处理后快速断头取出脑组织并分离海马组织，将其速冻后行冰冻切片，使用TUNEL法对细胞凋亡情况进行分析。

1.4 统计学方法:对所得数据应用SPSS15.0软件进行统计学分析，计量资料使用均数±标准差(±s)表示，行单因素方差分析，多组间行F值检验，计数资料以率表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠行为学测定结果分析:模型组大鼠的平台潜伏期显著高于假手术组，而普罗布考组对应时间点下的平台潜伏期模型组明显降低(P＜0.01)。普罗布考组在原平台象限的停留时间较模型组有明显的提高(P＜0.01)，见表 1。

表1 三组大鼠行为学测定结果比较(±s)

表1 三组大鼠行为学测定结果比较(±s)

注:a 与假手术组比较，P＜0.01;b 与模型组比较，P＜0.01

组别 例数 平台逃避潜伏期第1d 第2d 第3d 原平台象限停留时间假手术组 8 26.37±4.16 21.38±5.13 17.84±3.52 36.11±3.47模型组 8 83.96±7.88a 79.32±8.67a 77.82±6.27a 18.76±5.97a普罗布考组 8 49.73±7.00ab 42.83±4.17ab 40.48±3.15ab 26.18±4.93ab F 值 －12.305 24.336 17.295 23.210 P 值 0.000 0.001 0.010 0.003

2.2 三组大鼠海马组织p38MAPK蛋白表达及神经元凋亡情况:三组大鼠海马组织内的p－p38MAPK表达即活化的p38MAPK水平存在显著统计学差异(P＜0.01)，血普罗布考组较模型组明显降低(P＜0.01);假手术组大鼠p－p38MAPK的表达较少。三组大鼠海马神经元凋亡情况:模型组与普罗布考组大鼠的凋亡细胞数明显增加，而假手术组大鼠仅有少量或者偶见凋亡细胞，普罗布考组凋亡细胞数明显少于模型组(P＜0.01)，见表 2。

表2 三组大鼠海马p38MAPK蛋白表达及神经元凋亡情况比较(±s)

表2 三组大鼠海马p38MAPK蛋白表达及神经元凋亡情况比较(±s)

注:a与假手术组比较，P＜0.01;b 与模型组比较，P＜0.01

组别 例数 p－p38MAPK/β－action光密度值 凋亡细胞数假手术组 6 0.163±0.024 18.33±1.84模型组 6 0.876±0.103a 218.47±10.14a普罗布考组 6 0.507±0.048ab 161.66±9.73ab F 值 33.942 24.597 P 值 0.001 0.005

3 讨论

血管性痴呆是因脑血管病变引发脑损伤从而进一步导致痴呆的病症，缺血及缺氧性脑损伤或者出血性脑损伤造成的病理组织损伤是血管性痴呆的主要特征，且伴有进行性智能减退［3］。血管性痴呆仅次于阿尔茨海默病，是痴呆类型中的较为常见病症，其发病率在近年来有上升趋势。

马大勇等［4］研究发现:动物在缺血再灌注时会激活p38MAPK信号转导途径，而p38MAPK信号转导是细胞外刺激信号与效应基因表达的重要连接，是中转也是桥梁，在机体炎症及细胞周期的调控以及应激情况方面都有p38MAPK参与，所以p38MAPK与神经系统疾病的关联成为近年研究热点。p38MAPK分子为p38MAPK信号转导途径当中的主要酶成员，在细胞没有受到刺激以前，p38MAPK会保持非磷酸化形态，并储存在细胞质当中，一旦细胞被体内或者体外各种因素刺激时，例如炎性因子、缺血缺氧等刺激时，p38MAPK就会出现磷酸化形式，表现出活化性反应，p38MAPK被磷酸化激活，并从细胞质进入到细胞核内，对基因转录进行调节。

在研究结果提示普罗布考对血管性痴呆大鼠的认知能力有明显调节作用，同时还观察到应用普罗布考后，血管性痴呆大鼠的海马CA1区细胞凋亡情况显著改善，磷酸化的p38MAPK表达也显著减少，提示对p38MAPK通路的抑制可能是普罗布考治疗血管性痴呆的机制。近年发现，普罗布考对于抗动脉粥样硬化、抗炎以及抗氧化应激也有明显的疗效。同时也具有防治心血管疾病及保护肝脏等多种作用，此外普罗布考对于神经元的重塑也有重要作用。

［1］ 姚细蕊.银杏叶提取物治疗血管性痴呆的疗效观察［J］.山西医药杂志，2012，(9):928～929.

［2］ 田新英，陈翔，汪婉，等.普罗布考对血管性痴呆大鼠认知功能及海马组织SOD、MDA水平的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2013，30(10):906～909.

［3］ Pallebage－Gamarallage MM，Galloway S，Takechi R，et al.Probucolsuppresses enterocytic accumulation of amyloid－β induced by saturatedfat and cholesterol feeding［J］.Lipids，2012，47(1):27～34.

［4］ 马大勇，范吉平，朱陵群.3种拟血管性痴呆大鼠模型的比较［J］.北京中医药大学学报，2011，34(12):832～835.