低强度脉冲超声经PI3K/Akt通路调控兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的作用机制研究

任莎莎，李雪萍，林强，程凯，夏鹏，杨怀春，高明霞

研究发现软骨细胞生物学改变与骨性关节炎(osteoarthritis，OA)的发生具有一定相关性[1-2]，软骨细胞凋亡与OA发病密切相关[3]。低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)在促进骨折愈合方面有确切疗效[4]，近几年将其用于软骨组织及其他软组织方面的研究也越来越多[5-6]。研究发现LIPUS能激活软骨细胞及诱导Ⅱ型胶原(Type Ⅱ Collagen，COL2)mRNA表达来促进COL2合成[7]；还可影响软骨细胞膜表面应力受体整合素表达，影响其下游局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)、磷脂酰肌醇3(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)力化学信号转导通路，调节软骨细胞外基质合成[8]。本研究主要应用LIPUS作用于体外培养的兔膝软骨细胞，分析LIPUS通过PI3K/Akt信号通路调控兔膝OA软骨细胞凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物：健康的1月龄普通级新西兰大白兔30只，由南京医科大学附属南京医院动物实验中心(青龙山动物饲养中心)提供，体质量2.0～2.5Kg，雌雄不限，于24h昼/夜循环、无限量供应水和食物的动物设备中单笼饲养。实验经南京医科大学附属南京医院伦理委员会批准。②主要器材及试剂：低强度脉冲超声仪(osteoarthritis Ⅲ，日本株式会社)，胎牛血清(Giboco公司)，高糖DMEM培养基(南京凯基生物有限公司)，胰蛋白酶(南京凯基生物有限公司)，Ⅱ型胶原酶(Life Sciences公司)，PI3K/Akt抑制剂(美国Selleck公司)，COL2抗体(德国Acris公司)，基质金属蛋白酶-13(matrixmetalloproteinase-13，MMP-13)抗体、Akt抗体、磷酸化Akt抗体、Bcl-2抗体(武汉博士德公司)，P53抗体(美国LSBio公司)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(德国Millipore公司)，电泳仪与湿式电转移槽(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法 ①造模：30只新西兰大白兔随机抽取24只进行造模，采用前交叉韧带切断(anterior cruciate ligament transection，ACLT)法制作OA动物模型[9]，统一选择兔右后膝为手术关节。对照组仅切开关节囊。术后肌肉注射青霉素20万U，每天2次，连续3d。制模3d后每日笼外放养1h，使其手术侧膝关节主动屈伸。②软骨细胞分离及培养：造模后第6周时处死实验兔，取膝股骨髁关节表面软骨，分离软骨细胞并培养，每天采用光学显微镜观察软骨细胞贴壁情况，细胞铺满瓶底30%～40%时，换液去除培养基中死亡细胞，细胞铺满瓶底80%～90%时传代，传至第2代于倒置相差显微镜下观察细胞形态，并进行COL2免疫组化染色鉴定。③分组干预：假手术处理实验兔第2代软骨细胞作为正常对照组(A组)，OA模型兔第2代软骨细胞分为OA模型组(B组)、OA+LIPUS组(C组)、OA+LY294002(PI3K/Akt抑制剂)组(D组)、OA+LY294002+LIPUS组(E组)，每组各6只。超声组细胞均给予LIPUS辐射，应用HT2009-1型低强度脉冲超声仪(日本，伊藤公司)，探头置于培养瓶下方，探头与培养瓶之间涂以耦合剂，耦合剂厚度不超过1mm，FREE模式，频率为3MHz，辐射强度为40mW/cm2，通断比为20%，每天辐射20min，每天1次，每周6d，持续1周。抑制剂组细胞给予PI3K/Akt抑制剂LY294002干预：将5mgLY294002干粉充分溶于325ul二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液中，配制成50umol/L的LY294002溶液，于-20°C冰箱储存，使用时将其按相应的比例加入上述已配好的培养基中。

1.3 评定标准 ①软骨组织HE染色及组织学评分：收集ACLT术侧及假手术处理实验兔胫骨平台关节软骨，置入中性福尔马林溶液中，准备行病理学分析。并采用改良Mankin评分法进行评分[10]，包括纤维化、基质分布、软骨细胞缺失及软骨细胞集落等方面，该评分分别在股骨内髁、外髁，内侧和外侧胫骨平台进行；最低4分，最高16分。由2位独立的观察者双盲评价并出具相关报告。②软骨细胞免疫组化染色鉴定：加片加盖玻片后在光学显微镜下观察并拍照。③western blot检测：检测各组软骨细胞中COL2、MMP-13、Akt、pAkt、P53、Bcl-2蛋白表达情况。

2 结果

2.1 兔膝关节软骨组织学观察及Mankin评分 正常关节软骨表面规则，染色均匀，见图1a；而OA关节软骨明显不规则，HE染色缺失，软骨细胞明显减少，见图1b。与A组比较，B组Mankin总分增高(P<0.05)，同时B组纤维化、基质分布及软骨细胞集落评分较A组明显增高(P<0.05)，但软骨细胞缺失评分与A组比较差异无统计学意义，见表1。

2.2 正常软骨细胞与OA软骨细胞免疫组化结果 第二代正常软骨细胞贴壁较快，主要呈星形、多边形，圆形核仁居于细胞中央，可见1～3个较清晰的核仁，需7d左右长满培养瓶90%；第二代OA软骨细胞较正常软骨细胞贴壁慢，进入指数生长期慢，主要呈多边形，其间夹杂不少树突样细胞，核仁肥大，增多，需12d左右长满培养瓶90%；见图2a～b。免疫组化可见正常软骨细胞COL2免疫组化染色呈阳性，细胞胞浆内有棕黄色颗粒物质，胞核基本无着色，见图2c；OA软骨细胞COL2免疫组化染色与正常软骨细胞相比，其胞浆颗粒颜色较浅，见图2d。

2.3 各组软骨细胞COL2、MMP-13、Akt、pAkt、P53、Bcl-2的Western表达 与A组比较，B组COL2、pAkt、Bcl-2蛋白表达均降低(P<0.05)，MMP-13、P53蛋白表达均增高(P<0.05)，Akt蛋白表达无明显差异，见图3，4。与B组比较，C组COL2、pAkt、Bcl-2蛋白含量均增高，MMP-13、P53蛋白含量均下降(P<0.05)；D组COL2、Bcl-2蛋白、pAkt含量均下降，MMP-13、P53蛋白含量均升高(P<0.05)；E组COL2、MMP-13、P53、Bcl-2、pAkt蛋白含量无明显变化，但与C、D组比较差异有统计学意义(P<0.05)；各组Akt蛋白含量比较无明显差异，见图5，6。

a.A组 b.B组

图1a～b A、B组软骨组织HE染色

项目A组B组Mankin总分5．00±0．8210．00±1．26a纤维化1．33±0．472．83±1．17a基质分布1．00±02．33±0．52a软骨细胞缺失1．67±0．522．17±0．75软骨细胞集落1．00±02．67±0．82a

与A组比较，aP<0.05

a.正常第二代软骨细胞 b.OA第二代软骨细胞

c.正常软骨细胞COL2 d.OA软骨细胞COL2

图2a～d 正常与OA软骨细胞鉴定

图3A组与B组COL2、MMP-13、P53及Bcl-2的Western blot结果比较(与A组比较，*P<0.05)

图4A组与B组Akt、pAkt的Western blot结果比较(与A组比较，*P<0.05)

图5B组、C组、D组及E组COL2、MMP-13、P53及Bcl-2的Western blot结果(*P<0.05)

图6B组、C组、D组及E组Akt、pAkt的Western blot结果(*P<0.05)

3 讨论

软骨细胞是成熟软骨组织内唯一的细胞类型，在软骨损伤及重塑过程中起着重要作用，其增殖能力、细胞形态及分泌COL2的量可反映软骨细胞的活性。体外培养软骨细胞有助于了解软骨细胞增殖、分化及合成细胞外基质过程中的影响因素，对研究OA病理等具有重要意义[11-12]。本研究通过体外培养正常、OA软骨细胞发现，第2代正常软骨细胞主要呈星形、多边形，生长快，其COL2免疫组化染色呈阳性；第2代OA软骨细胞生长慢，主要呈多边形，其间夹杂不少树突样细胞，其COL2免疫组化染色相对正常软骨细胞，胞浆棕黄色颗粒变浅，提示OA软骨细胞培养成功。

软骨细胞外基质由COL2、蛋白多糖等构成，COL2约占基质总量的80%-90%，由软骨细胞分泌[13]。MMPs是降解细胞外基质最重要的蛋白水解系统，其中MMP-13主要降解COL2[14-15]。正常关节软骨中可发生细胞凋亡，是维持关节内微环境稳定等所必需的生理现象；研究发现软骨细胞凋亡与基质降解密切相关，OA软骨细胞过度凋亡，可致基质合成减少，逐渐形成恶性循环，是关节软骨退变发展成骨性关节炎的重要原因[16]。

PI3K/Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为整合素下游信号通路之一，该通路是调节软骨细胞生长、基质重塑及抗软骨细胞凋亡最重要的信号转导通路[17]。PI3K是一种膜蛋白，可接收膜上的酪氨酸激酶受体、细胞因子受体、CD19、BCR等传入信号，从而直接或间接激活下游因子Akt，激活后的Akt主要通过对含有丝氨酸残基或苏氨酸残基的底物(P53、NF-κB及Caspase-9等)磷酸化而发挥生物学效应[18]。研究表明PI3K/Akt通路与促凋亡因子P53及抗凋亡因子Bcl-2存在关联性；正常和OA软骨细胞内均有P53表达，OA软骨细胞表达更高，其下调可抑制OA软骨细胞凋亡[19]；P53基因还能诱导Bax基因表达，抑制Bcl-2基因表达，提示P53基因与Bcl-2基因家族在调控细胞方面也具有相关性[20]；Bcl-2 基因是Bcl-2家族成员之一，具有抑制细胞凋亡和延长细胞寿命等功能，可部分抑制NO诱导的软骨细胞凋亡[21]。

本研究结果显示，A组与B组软骨细胞内均可表达COL2、MMP-13、Akt、pAkt、P53、Bcl-2蛋白；B组COL2、pAkt、Bcl-2蛋白表达量低于A组，而MMP-13、P53蛋白表达量高于A组，两者Akt蛋白表达量无明显差异。进一步证明OA病理过程与软骨细胞凋亡密切相关。

近年来研究发现LIPUS可诱导软骨细胞中COL2和蛋白多糖基因表达，对IL-1β诱导的MMP-13的表达有抑制作用，利于软骨细胞表型的稳定[22]。LIPUS可增加增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达，促进软骨细胞增殖，该作用机制可能与PI3K/Akt信号转导通路相关[23]；还可激活退变人髓核细胞内的PI3K/Akt信号通路来促进细胞外基质合成[24]。LIPUS影响OA软骨细胞凋亡的作用主要是通过机械效应来实现，其机械效应可对细胞膜产生一种微应力，使整合素蛋白在细胞膜发生聚集，当逐渐聚集达到一定量时，细胞内第一个信号分子局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK) 被磷酸化而激活，FAK的激活使PI3K的p85亚基发生磷酸化从而激活PI3K/Akt信号通路产生相应的生物学效应[25]。

本研究结果表明OA软骨细胞予以LIPUS刺激后Akt磷酸化水平升高同时MMP-13、P53表达水平降低，Bcl-2、COL2表达水平增高；加入PI3K特异性抑制剂LY294002共培养后，Akt磷酸化水平降低的同时MMP-13、P53表达水平增高，pAkt、COL2、Bcl-2蛋白表达水平降低，提示LIPUS照射能促进Akt的磷酸化进而激活PI3K/Akt信号转导通路来抑制炎症因子MMP-13表达，从而减少细胞外基质COL2降解；抑制促凋亡基因P53蛋白表达，促进抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达，对OA软骨细胞具有保护作用。

综上所述， 本研究发现LIPUS可经PI3K/Akt通路上调抗凋亡基因Bcl-2表达，下调促凋亡基因P53表达，降低兔膝OA软骨细胞凋亡率，调节细胞外基质合成，从而促进OA关节软骨损伤的修复、延缓关节软骨退变，起到一定的保护软骨的作用。但LIPUS对于晚期OA软骨细胞及人软骨细胞是否具有相同作用目前还无法证实，因此还需日后进一步深入研究。

[1] Setton LA, Mow VC, Muller FJ, et al. Mechanical behavior and biochemical composition of canine knee cartilage following periods of joint disuse with remobilization[J]. Osteoarthritis Cartilage 1997, 5(1):1-16.

[2] Schroeppel JP, Crist JD, Anderson HC, et al. Molecular regulation of articular chondrocyte function and its significance in osteoarthritis[J]. Histol Histopathol, 2011, 26(3):377-394.

[3] Kim HA, Blanco FJ. Cell death and apoptosis in osteoarthritic cartilage[J]. Curr Drug Targets, 2007, 8(2):333-345.

[4] Martinez de Albornoz P, Khanna A, Longo UG, et al. The evidence of low-intensity pulsed ultrasound for in vitro，animal and human fracture healing[J]．Br Med Bull, 2011, 100(1): 39-57．

[5] Griffith JF, Wang YX, Antonio GE, et al．Modified Pfirrmann grading system for lumbar intervertebral disc degeneration[J]．Spine, 2007, 32(24) : E708-E712．

[6] Ciapetti G, Granchi D, Devescovi V, et al．Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs[J]．Eur Spine J, 2012, 21 (Suppl 1) : S10-S19.

[7] Naito K, Watari T, Muta T, et al. Low-Intensity Pulsed Ultrasound (LIPUS) Increases the Articular Cartilage Type II Collagen in a Rat Osteoarthritis Model[J]. J Orthop Res,2010,28(3):361-369.

[8] Cheng K, Xia P, Lin Q, et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on integrin-FAK-PI3K/Akt mechanochemical transduction in rabbit osteoarthritis chondrocytes[J]. Ultrasound Med Biol, 2014,40(7):1609-1618.

[9] Jean YH, Wen ZH, Chang YC, et al. Increase in excitatory amino acid concentration and transporters expression in osteoarthritic knees of anterior cruciate ligament transected rabbits[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2008,16(12):1442-1449.

[10] Gurkan I, Ranganathan A, Yang X, et al. Modification of osteoarthritis in the guinea pig with pulsed low-intensity ultrasound treatment[J]. Osteoarthritis Cartilage,2010, 18(5):724-733.

[11] Damjanovich S, Nagy I, Somogyi B, et al. Application of a molecular enzyme kinetic model for aging cells and tissues[J]. Arch Gerontol Geriatr,1989,8(1):37-45.

[12] Smith RL, Lin J, Trindade MC,et al. Time-dependent effects of intermittent hydrostatic pressure on articular chondrocyte type II collagen and aggrecan mRNA expression[J]. J Reharbil Res Dev,2000,37(2):153-163.

[13] Takaishi H, Kimura T, Dalal S et al. Joint disease and matrix metalloporteinases:a role for MMP-13[J]. Curr Pharm Biotechnol,2008,9(1):47-54.

[14] Prasadam I, Crawford R, Xiao Y. Aggravation of ADAMTS and matrix metalloproteinase production and role of ERK1/2 pathway in the interaction of osteoarthritic subchondral bone osteoblasts and articular cartilage chondrocytes——possible pathogenic role in osteoarthritis[J]. J Rheumatol,2012,39(3): 621-634.

[15] Jiezhong C, Ross C, Yin X. Vertical inhibition of the PI3K/Akt/mTOR pathway for the treament of osteoarthritis[J]. J Cell Biochem 2013 ,114(2):245-249.

[16] Musumeci G, Loreto C, Carnazza ML, et al. Characterization of apoptosis in articular cartilage derived from the knee joints of patients with osteoarthritis[J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 2011, 19(2):307-313.

[17] Tong KM, Shieh DC, Chen CP, et a1. Leptin induces IL-8 expression via leptin receptor, IRS-1, PI3K, Akt cascade and promotion of NF-kappaB/p300 binding in human synovial flbmblasts[J]. Cell Signal, 2008, 20(8):1478-1488.

[18] Hofler A, Nichols T, Grant S, et a1. Study of the PDK1/AKT signaling pathway using selective PDK1 inhibitors, HCS and enhanced biochemical assays[J]. Anal Biochem, 2011,414(5):179-186.

[19] Hashimoto S, Nishiyama T, Hayashi S, et al. Role of p53 in human chondrocyte apoptosis in response to shear strain[J]. Arthritis Rheum, 2009, 60(8):2340-2349.

[20] Miyashita T, Reed JC. Tumor suppressor P53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene[J]. Cell, 1995,80(2):293-299.

[21] Oshima Y, Akiyama T, Hikita A, et al. Pivotal role of Bcl-2 family proteins in the regulation of chondrocyte apoptosis[J]. J Biol Chem, 2008, 283(39):26499-26508.

[22] Zhang ZJ, Huckle J, Francomano CA, et al. The effects of pulsed low intensity ultrasound on chondrocyte viability, proliferation, gene expression and matrix production[J].Ultrasound Med Biol, 2003,29(11):1645-1650.

[23] Li X, Lin Q, Wang D, et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes early proliferation of knee articular chondrocytes by activating phosphatidylinositol 3 kinase pathway in a rabbit osteoarthritis model[J]. Adv Sci Lett,2012,5(1):217-221.

[24] 张晓军, 胡侦明, 郝杰,等.低强度脉冲超声通过PI3K/Akt通路促进人退变髓核细胞合成细胞外基质[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2013, 29(1): 34-38.

[25] Watabe H, Furuhama T, Tani-Ishii N, et al．Mechanotransduction activates α5β1 integrin and PI3K/Akt signaling pathways in mandibular osteoblasts[J]．Exp Cell Res, 2011, 317(18) :2642-2649．