猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建及其表达

杨凤娇，周必英

猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建及其表达

杨凤娇，周必英

目的 构建猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗，研究TSOL18基因在BCG中的表达情况。方法 通过酶切的方法从重组质粒pGEX-TSOL18获取猪带绦虫TSOL18基因，将其定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV261中，构建猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18，进行酶切、PCR和测序鉴定；再将其电穿孔转化入BCG，构建猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗,进行PCR鉴定；SDS-PAGE和Western blot分析TSOL18基因在BCG中的表达情况。结果 通过酶切成功获得了393 bp的TSOL18基因片段；酶切、PCR和测序鉴定证明成功构建了猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18；PCR鉴定证实猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18成功转入BCG中，提示猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建成功；SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约为14.7 kD处有明显的TSOL18目的蛋白条带，Western blot证实表达的TSOL18目的蛋白能被兔抗血清和囊虫病猪血清所识别。结论 成功构建了猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗，TSOL18基因能够在BCG中成功表达，表达的TSOL18重组蛋白具有特异的抗原性，为该疫苗的进一步研究奠定了基础。

猪带绦虫；重组BCG-TSOL18疫苗；构建；表达

猪囊尾蚴病(cysticercosis cellulosae)是由猪带绦虫(Taeniasolium)的续绦期幼虫猪囊尾蚴寄生于人或猪引起的一种严重危害人类健康和畜牧业生产的人兽共患寄生虫病，该病呈世界性分布，在我国主要流行于东北、华北、西北及西南等地区，全国囊虫病患者约200万～300万，感染率达0.14%～3.20%[1]。由于该病的化疗存在严重的毒副作用和耐药性，外科手术治疗需要掌握合适的手术时机和适应症[2]，使得研制有效的疫苗防治该病已成为当前研究热点。

TSOL18基因存在于猪带绦虫六钩蚴中，具有较好的免疫原性和抗原性，是最具前景的猪带绦虫疫苗候选分子[3-4]。卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)是一种减毒牛型分枝杆菌，广泛用于结核病的预防。随着基因工程技术的发展，选择具有安全性和免疫佐剂作用的BCG作为载体，已在细菌、病毒、肿瘤、寄生虫等领域构建了一系列重组BCG疫苗[5-8]。而就寄生虫领域，尚未见猪带绦虫重组BCG疫苗的报道。因此，本研究拟通过酶切的方法从猪带绦虫重组质粒pGEX-TSOL18[9]获得猪带绦虫TSOL18目的基因，将其定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV261中，构建猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18，再将其电转入BCG，构建猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗，研究TSOL18基因在BCG中的表达情况，从而为猪囊尾蚴病的防治提供一种新型疫苗。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 猪带绦虫重组质粒pGEX-TSOL18和兔抗血清由本课题组前期制备保存[9]；质粒pMV261购自美国Addgene公司；大肠埃希菌(E.coli)DH5α、兔抗TSOL18血清和囊虫病猪血清由本室保存；BCG冻干粉由遵义市疾病预防控制中心提供；质粒小量提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购自美国AXYGEN公司；Taq DNA Polymerase、BamH I、EcoR I、T4DNA连接酶、DNA Marker和蛋白Marker购自日本Takara公司；Middle Brook 7H9 Broth(M7H9)培养基、偶氮甲酰胺(Ablumin-dextrose complex ,ADC)Enrichment购自美国Difco公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司；其它试剂均为国产分析纯。核酸/蛋白电泳装置购自北京六一仪器厂；PCR仪购自美国MJ-Research公司。

1.2 质粒pMV261的扩增与鉴定 制备E.coliDH5α感受态细胞，将质粒转化至E.coliDH5α感受态细胞，冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，冰浴5 min，冷却后加入400 μL Luria-Bertanig(LB)培养液，37 ℃ 200 r/min振摇1 h，离心，弃上清后，以100 μL LB培养液重悬菌液，取重悬菌液混匀涂布含50 μg/mL卡那霉素(kana)的LB琼脂平板上，37 ℃倒置培养过夜。挑取单菌落至含50 μg/mL Kana的LB培养液中，37 ℃ 250 r/min振摇培养4 h，待菌液浑浊后备用，质粒小量快速抽提并纯化，进行质粒测序及酶切鉴定。

1.3 猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18的构建及鉴定 将本室制备保存的重组质粒pGEX-TSOL18[9]和鉴定正确的质粒pMV261分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切产物经电泳、胶回收相应片段后用T4DNA连接酶16 ℃连接过夜，转化至E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，抽提质粒，进行酶切、PCR及测序鉴定。

1.4 BCG感受态细菌的制备 将BCG冻干粉用无菌水溶解后取1 mL接种于含有10% ADC的M7H9-Tween80液体培养基中，37 ℃培养至菌体OD600达0.5～1.0对数生长期；冰浴2.5 h, 5 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用预冷的10%甘油清洗2次；再用初始培养物1/20体积预冷的10%甘油，重悬混匀，100 μL每管分装于预冷的1.5 mL离心管中；此细菌可立即用于电转化，或者-70 ℃冻存备用。

1.5 猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18电转化BCG感受态细菌 取备用的重组质粒pMV261-TSOL18 5～15 μg与BCG感受态细菌100 μL充分混匀，冰浴10 min后转移至0.1 cm电转杯中，电击参数设置为：电压1.8 kV、间隔800 ms、脉冲150 μs，共35次，其中转化时间5 ms；电转化后立即加入1 mL的M7H9ADC液体培养基，轻轻混匀后转移至玻璃试管内，37 ℃ 80 r/min振荡培养5 h；取100 μL涂布于含有25 μg/mL Kana的M7H9ADC固体培养基，37 ℃培养约4～6周，筛选阳性菌落。

1.6 猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗的PCR鉴定 挑取上述M7H9ADC固体培养基中的单个菌落至含有25 μg/mL Kana的M7H9ADC液体培养基中，37 ℃ 150 r/min振荡培养至OD600约1.0；取1 mL菌液，10 000 r/min离心10 min；弃上清，ddH2O洗涤3次，10 000 r/min离心弃上清,加入30 μL的ddH2O，重悬后沸水浴10 min；冰浴2 min，10 000 r/min离心10 min；吸取上清作为PCR模板，进行PCR鉴定。用于PCR鉴定的引物为P1(5′-ATGGTGTGTCGGTTTGCTCTCAT-3′)和P2(5′-CTACGATCTTCGGACCTTCTTGTG-3′)，引物由南京钟鼎生物公司合成。反应体系为：以P1、P2为引物各1 μL，1 μL菌液为模板，10×Buffer (plus Mg2+)5 μL，dNTP Mixture 5 μL，Taq DNA Polymerase 1 μL,ddH2O 36 μL；PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s,50 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，循环扩增35次，最后72 ℃延伸7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.7 重组BCG-TSOL18疫苗的诱导表达 将经PCR鉴定含有pMV261-TSOL18质粒的rBCG接种于M7H9ADC液体培养基中；37 ℃培养约4周至对数生长期；收集菌体前3 d，每天45 ℃热诱导45 min，每天1次，共3次。

1.8 SDS-PAGE鉴定 取1 mL热诱导后的rBCG菌液，6 000 r/min，4 ℃离心15 min收集细菌，将BCG悬浮于预冷的PBS中；在冰浴中超声裂解20 min；加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水浴4～8 min，取30 μL作SDS-PAGE分析,用R250考马斯亮蓝染色,甲醇/冰乙酸脱色。

1.9 Western blot分析 将菌体蛋白作SDS-PAGE后，用湿法转移系统将凝胶上的蛋白转印到PVDF上，于封闭液中室温摇床封闭2 h，用PBS漂洗5 min,用1∶1 000稀释的兔抗TSOL18血清及1∶200稀释的囊虫病猪血清4 ℃封闭过夜，37 ℃ PBST漂洗3次，每次5 min；用1∶1 500稀释的HRP标记鼠抗兔血清及鼠抗猪血清37 ℃孵育1 h，37 ℃ PBST漂洗4次，每次5 min，用ECL显色剂与PVDF膜避光反应3 min，曝光后进行Western blot分析。

2 结 果

2.1 质粒pMV261的鉴定 扩增的质粒pMV261小量抽提后经Hind III单酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳，得到大小约为4 500 bp单一直链条带，与4 488 bp的pMV261大小一致，验证其确为pMV261，见图1；质粒经测序，通过与pMV261官方标准序列比对，匹配度为100%，验证其确为pMV261。

M:DNA Marker; 1:Plasmid pMV261; 2:Restriction enzyme analysis of pMV261 withHind III.

图1 空质粒pMV261单酶切鉴定

Fig.1 Identification of restriction analysis of the plasmid pMV261

2.2 TSOL18目的基因的获取 重组质粒pGEX-TSOL18经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳，得到4 944 bp的pGEX-1λT载体片段和393 bp的TSOL18目的基因片段，与预期结果相符，见图2。

M:DNA Marker; 1:Restriction enzyme analysis of the pGEX-TSOL18 withBamHⅠ/EcoRⅠ.

图2 重组质粒pGEX-TSOL18双酶切鉴定

Fig.2 Identification of restriction analysis of the recombinant plasmid pGEX-TSOL18

2.3 猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18的酶切鉴定 重组质粒pMV261-TSOL18经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，用l%琼脂糖凝胶电泳，得到4 488 bp的pMV261载体片段和393 bp的TSOL18基因片段，与预期结果相符，见图3。

M:DNA Marker; 1:Production of restriction enzyme of the recombinant plasmid pMV261-TSOL18.

图3 重组质粒pMV261-TSOL18的双酶切鉴定

Fig.3 Identification of restriction enzyme of the recombinant plasmid pMV261-TSOL18

2.4 猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18的PCR鉴定 以含质粒pMV261-TSOL18的重组菌为模板进行PCR，经l%琼脂糖凝胶电泳后得到393 bp的TSOL18目的基因，与预期结果相符，见图4；质粒经测序，通过与TSOL18基因标准序列比对，匹配度为100%，证实获得的TSOL18基因正确地插入到pMV261载体的BamHⅠ/EcoRI之间，与预期结果相符。

2.5 猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗的PCR鉴定 以含重组质粒pMV261-TSOL18的BCG转化菌为模板进行PCR，其中1、3、4、5、7泳道为rBCG阳性菌的PCR产物，可得到393 bp的TSOL18 基因片段，与预期结果相符，见图5。

M:DNA Marker; 1:PCR product of the recombinant plasmid pMV261-TSOL18.

图4 重组质粒pMV261-TSOL18的PCR鉴定

Fig.4 PCR identification of the recombinant plasmid pMV261-TSOL18

M:DNA Marker; 1,3,4,5,7:PCR production of rBCG positive bacteria; 2,6:PCR production of rBCG negative bacteria.

图5 猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗的PCR鉴定

Fig.5 PCR identification of the recombinant BCG-TSOL18 vaccine ofTaeniasolium

2.6 重组BCG-TSOL18疫苗表达产物的SDS-PAGE分析 rBCG培养至对数生长期后，经45 ℃热诱导后进行SDS-PAGE电泳，在Mr为14.7 kD处可见明显的表达条带，与393 bp的TSOL18基因编码130个氨基酸的理论分子质量基本相符，结果见图6。

2.7 重组BCG-TSOL18疫苗表达产物的Western blot分析 重组BCG-TSOL18疫苗表达产物与兔抗血清、囊虫病猪血清反应后，在Mr约为14.7 kD处出现明显的反应带，结果见图7A、B。

3 讨 论

TSOL18基因是Gauci等[10-11]从猪带绦虫六钩蚴cDNA文库中分离得到的一个长度为579 bp片段,其中390 bp可编码相对分子质量(Mr)为14.7 kDa的含130个氨基酸的蛋白质。该基因相对保守，存在于激活的猪带绦虫六钩蚴中，具有较好的免疫原性和抗原性，在猪带绦虫六钩蚴入侵小肠绒毛上皮的过程中起重要作用，是最具开发价值的疫苗候选抗原之一。随后国内外学者相继进行了TSOL18基因的重组蛋白疫苗、DNA疫苗、重组酵母疫苗、重组鼠伤寒沙门氏杆菌疫苗的研究[12-15]，但是人们发现重组蛋白疫苗需要经过基因克隆、表达和蛋白纯化等复杂过程，技术难度大，成本较高，同时它只能诱导体液免疫和Th细胞应答，不能诱导细胞毒性T淋巴细胞应答(CTL)；DNA疫苗操作简单，能同时诱导体液免疫、Th细胞和CTL应答，但DNA可整合到宿主细胞的基因组中，有引起原癌基因活化和抑制基因失活的危险；重组毕赤酵母中表达蛋白存在过度糖基化，可能影响重组蛋白的合成与分泌，且糖基化后的蛋白具有高度异质性，会使重组蛋白发生功能改变[16]；鼠伤寒沙门氏杆菌属于革兰阴性菌，其在体内表达产生的脂多糖毒素可能对宿主细胞有毒性，可能会干扰编码基因在宿主细胞中的正确表达和合成，并且存在细菌毒力返强的危险性。针对以上疫苗存在的不足，因此，有必要研究新型的猪带绦虫疫苗。

M:Protein Marker; 1-3:Expression production of rBCG induced by heating; 4:BCG control.

图6 TSOL18基因在BCG中表达的SDS-PAGE鉴定

Fig.6 SDS-PAGE identification of TSOL18 expression in BCG

1-3:TSOL18 protein reacted with rabbit antiserum (A)or cysticercosis swine serum(B); 4:BCG control.

图7 TSOL18基因在BCG中表达的Western blot鉴定

Fig.7 Western blot identification of TSOL18 expression in BCG

BCG是一种减毒牛型分支杆菌，是目前唯一用于预防结核病的疫苗。因其具有安全性和免疫佐剂作用，随着基因工程技术的发展，选择BCG作为载体构建疫苗的研究越来越受重视。该疫苗具有以下优点：①BCG不仅是抗结核病的活疫苗，而且是一种强免疫佐剂，主要介导细胞免疫应答，也能诱导体液免疫应答，BCG分泌的胞外蛋白可能在诱导细胞介导的保护性免疫反应中起重要作用，所表达的靶抗原不需纯化，可直接用于免疫保护试验，免去了蛋白质后处理的复杂工序；②BCG是活菌苗，在体内不断表达外源抗原，用单次接种即可持续诱导对靶抗原的免疫反应，免疫持久，可提高宿主的免疫力；③BCG用于人是安全的，它是WHO推荐的两种出生时即可接种的活疫苗之一，生产成本较低，热稳定性强，易于保存；④经口服可诱导有效的黏膜免疫，是一种极具吸引力的活疫苗载体[17-18]。因此，选择BCG作为载体构建猪带绦虫的重组BCG疫苗，可能是预防和控制猪囊尾蚴病的一种较安全可靠的新型疫苗。

为了将外源DNA有效引入BCG，本研究选用了大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261。该质粒添加了aph基因(即卡那霉素抗性标记)、多克隆位点、分枝杆菌强启动子热休克蛋白60(hsp60)和转录终止子，发现pMV261均能在大肠杆菌和结核杆菌中正常表达，具有高拷贝、高表达重组蛋白以及对BCG基因组的非破坏性等优点[19-20]。本研究在前期构建猪带绦虫重组质粒pGEX-TSOL18的基础上，采用酶切的方法从该质粒中成功获得了393 bp的TSOL18目的基因，将其定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV261中，构建猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18，经双酶切、PCR和测序鉴定，证实TSOL18基因成功插入pMV261中；然后将重组质粒pMV261-TSOL18电穿孔转化BCG，构建猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗，以从具有卡那霉素抗性的M7H9ADC液体培养基中筛选阳性菌液为模板进行PCR鉴定，证实猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建成功。

外源基因在rBCG中的有效表达是疫苗发挥作用的基础。本文用SDS-PAGE分析rBCG疫苗的表达产物时发现含pMV261-TSOL18的rBCG菌经热诱导后，在Mr约为14.7 KD处有明显的目的蛋白条带，与预期结果相符；Western blot显示表达的目的蛋白能被兔抗TSOL18血清和囊虫病猪血清所识别，而BCG菌无目的蛋白条带，提示TSOL18基因能够在BCG中成功表达，且表达的蛋白具有特异的抗原性，为该疫苗的进一步研究奠定了基础。

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Construction and expression of a recombinant BCG-TSOL18 vaccine ofTaeniasolium

YANG Feng-jiao,ZHOU Bi-ying

(DepartmentofParasitology,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China)

We constructed a recombinant Bacillus Calmette-Guerin(BCG)-TSOL18 vaccine ofTaeniasoliumand observed the expression of the TSOL18 gene in BCG. The TSOL18 gene ofTaeniasoliumwas obtained from the recombinant plasmid pGEX-TSOL18 by digestion method and cloned intoEscherichiacoli(E.coli)-mycobacterium shuttle plasmid pMV261 to construct the recombinant plasmid pMV261-TSOL18 ofTaeniasolium, and the recombinant plasmid was identified by restriction enzyme digestion, PCR and DNA sequencing. Then, the recombinant plasmid was transformed into BCG by electroporation to construct the recombinant BCG-TSOL18 vaccine ofTaeniasolium, and the vaccine was identified by PCR. The expression of the TSOL18 gene in BCG was identified by SDS-PAGE and Western blot. The 393 bp TSOL18 gene fragment was successfully obtained by restriction enzyme digestion. Restriction enzyme digestion, PCR and DNA sequencing suggested that the recombinant plasmid pMV261-TSOL18 ofTaeniasoliumwas successfully constructed. PCR confirmed that the recombinant plasmid pMV261-TSOL18 ofTaeniasoliumwas successfully transformed into BCG, suggesting that the recombinant BCG-TSOL18 vaccine ofTaeniasoliumwas successfully constructed. SDS-PAGE showed that the relative molecular mass (Mr) of TSOL18 target protein was approximately 14.7 kD. Results of western blot showed the TSOL18 target protein could be recognized by rabbit antiserum or cysticercosis swine serum. The recombinant BCG-TSOL18 vaccine ofTaeniasoliumwas successfully constructed. The TSOL18 gene ofTaeniasoliumwas successfully expressed in BCG and the expressed TSOL18 recombinant protein had specific antigenicity. This result would lay a foundation for further study of the vaccine.

Taeniasolium; recombinant BCG-TSOL18 vaccine; construction; expression

Zhou Bi-ying,Email:zbyzl01@126.com

周必英，Email：zbyzl01@126.com

遵义医学院寄生虫学教研室，遵义 563000

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.012

R383.33

A

1002-2694(2015)10-0952-05

2015-01-26；

2015-07-28

贵州省科技厅社会发展攻关项目(黔科合SY字[2011]3038号)

Supported by the Social Research Project of Science and Technology Department of Guizhou Province (No.SY [2011]3038)