新型鸭呼肠孤病毒S组基因克隆及序列分析

卿柯香，袁远华，郭霄峰，黄淑坚

根据国际病毒分类委员会第九次报告，正呼肠孤病毒属依然分3 个亚群：第Ⅰ亚群包括不含融合基因的哺乳动物呼肠孤病毒（Mammalian reoviruses，MRV）；第Ⅱ亚群包括具有融合基因的禽呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）和内尔森海湾病毒（Nelson Bay virus，NBV）；第Ⅲ亚群包括狒狒呼肠孤病毒（Baboon reovirus，BRV）；从蛇分离到的两株呼肠孤病毒暂且将其归为第Ⅳ亚群[1-2]。其中禽呼肠孤病毒包含鸡源、火鸡源、鹅源、番鸭源的呼肠孤病毒。

新型鸭呼肠孤病毒（New-type duck reovirus，NDRV）病，是一种以肝脏不规则坏死、出血斑/点和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病，各品种鸭（如番鸭、半番鸭、麻鸭、北京鸭等）均可感染发病。该病病原为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，一种分节段的dsRNA病毒[3]。NDRV含有10个RNA片段，即3 个大基因Ll、L2、L3，分别编码λA、λB、λC3 种蛋白；3 个中基因M1、M2、M3，分别编码μA、μB和μNS5 种蛋白；4 个小基因S1、S2、S3 和S4，分别编码P10、P18、σC、σA、σB和σNS6 种蛋白[4]。

本实验室从临床病料分离到1 株新型鸭呼肠孤病毒，并命名为NDRV-QY 株[5]。为了解QY 株病毒与其他正呼肠孤病毒的遗传进化关系，本试验将QY 株的S组基因核苷酸序列与国内外参考毒株进行了比对和分析，以初步明确该株病毒的分类地位。

1 材料与方法

1.1 病毒株及工程菌 新型鸭呼肠孤病毒（NDRVQY）、工程菌大肠杆菌DH5α感受态细胞由佛山科学技术学院生命科学学院传染病室提供。

1.2 主要试剂 RNAiso Reagent，购自美国Invitrogen 公司；反转录试剂盒、Premix ExTaqTMVersion2.0、pMD18-T 载体、DNAMarker（DL-2 000），均购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit（2000）为OMEGA公司产品。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物的设计与合成 参照GenBank 中登录的NDRVS1、S2、S3 和S4 基因序列（JX478256、JF320803、GQ888710、GU338025），用Primer Primer5.0 软件设计合成了覆盖S1、S2、S3 和S4 基因开放阅读框的多对特异性引物（见表1）。……