脂联素基因多态性与结直肠癌发病风险关联性研究＊

向德森，张 敬，肖 杰，冉文华，黄自铎，周 涛

（重庆市黔江中心医院普外科 409000）

已有前瞻性研究显示，循环脂联素水平与结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病风险存在负相关关系。美国的护士健康研究（NHS）和卫生专业人员随访研究（HPFS）等两个大型的前瞻性队列研究结果表明，仅在男性人群中观察到低水平脂联素与CRC的发病风险存在联系［1］。然而，观察性研究存在固有的局限性，如无法很好地控制混杂因素，难以建立暴露因素与疾病发生之间的因果关系。而利用个体遗传变异可能会影响循环中的脂联素水平，从而可为脂联素与CRC发病风险提供因果证据。在配子形成过程中，等位基因的分配是独立的，即类似于干预试验的随机化。此等位基因的分配可确保遗传变异与疾病结局之间的关联无法被其他常见混杂因素打破。

此前的全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出几个可影响血循环脂联素水平的单核苷酸多态性位点［2－3］。已有研究表明，脂联素及其受体基因的多态性会影响血循环脂联素水平，但国内鲜少有关于脂联素基因多态性与CRC发病风险的研究报道。本研究对本院CRC患者行脂联素3个基因多态性位点进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究采用病例对照研究，研究对象来源于2010年1月至2014年1月在本院诊治或健康查体者。病例组纳入标准：病理组织学确诊为原发CRC、无合并其他肿瘤，在行放射化学治疗前，以同意抽取10mL血液进行遗传学检查者纳入；排除标准：合并2项或以上肿瘤、CRC为转移癌、有糖尿病病史或已接受放射化学治疗者。对照组纳入标准：无恶性肿瘤病史、无糖尿病病史，来本院行健康体检，且同意抽取10 mL血液进行遗传学检查者。对照组的性别及年龄（±5岁）与病例组匹配。纳入病例、对照各250例，其中病例组患者43～68岁，平均（55.8±8.0）岁；对照组患者46～69岁，平均（55.5±7.8）岁。

1.2 方法

表1 基因多态位点引物设计

表2 基因多态位点探针设计

1.2.1 试剂与设备 Taqman荧光定量PCR仪ABI7900；脂联素基因的3个基因多态性位点：脂联素5′端侧翼区－11377C/G位点：rs266729，外显子2区＋45T/G位点：rs2241766，以及内含子2区＋276G/T位点：rs1501299。使用VIC及FAM标记探针。此3个位点的引物由美国ABI公司合成，PCR试剂及引物均购自美国ABI公司，DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司。反应所用的基因多态位点引物信息见表1，探针信息见表2。

1.2.2 样本DNA提取及脂联素基因分型 抽取研究对象外周血，利用柱式抽提试剂盒抽提样本DNA。采用荧光定量PCR技术，检测rs266729、rs2241766和rs1501299的基因多态性。每个反应体系总体积5.0μL，包含DNA模板（浓度为30～100ng/μL）1.0μL，2×Taqman通用 MasterMix 2.5μL，每条引物浓度为225nmol/L，每条探针浓度为50nmol/L。反应条件为55℃2min，95℃10min，随后进行35个循环的扩增（90℃30s，60℃1min）。在测量等位基因特异性荧光后，用SDS软件分析基因型别。为确保基因分型的准确性，随机重复10.0%的样品，结果一致性符合率为100.0%。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0软件进行统计分析，基因计数法统计基因型频率和等位基因频率。基因型别、基因－基因、基因－环境交互作用采用Logistic回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般人口学特征 两组对象性别相匹配，病例组、对照组各纳入女48例，男202例。两组间在年龄方面差异无统计学意义（t＝0.37，P＝0.714）。病例组的体质量指数（BMI）较对照组高，差异有统计学意义（t＝4.68，P＝0.000），见表3。病例组有肿瘤家族史25例，对照组有肿瘤家族史8例，两组比较差异有统计学意义（χ2＝9.38，P＝0.002）。

表3 研究对象人口学特征（±s）

表3 研究对象人口学特征（±s）

变量 病例组 对照组t P年龄（岁）≥60 64.35±2.78 64.23±2.66 0.31 0.401＜60 49.37±3.30 49.44±3.11 0.18 0.524 BMI（kg/m2）24.24±2.57 23.61±2.42 4.68 0.000

2.2 脂联素3个基因多态性位点与CRC发病风险 脂联素－11377C/G位点（rs266729）病例组突变型（GG）及G等位基因携带者（CG、CG＋GG）均高于对照组（P＝0.047、0.016、0.007）。对于脂联素＋45T/G位点（rs2241766），病例组的 G等位基因携带者（TG、TG＋GG）高于对照组（P＝0.046、0.040）。对于脂联素＋276G/T位点（rs1501299），病例组T等位基因携带者（TG、TG＋TT）低于对照组（P＝0.011、0.007），见表4。

表4 脂联素基因多态性与CRC发病风险

2.3 脂联素基因－基因交互作用与CRC发病风险的关系 条件Logistic回归分析显示，脂联素的3个基因多态性位点间不存在基因－基因交互作用，见表5。

2.4 脂联素基因－环境交互作用与CRC发病风险的关系 恶性肿瘤家族史与BMI之间的交互作用并未影响CRC的发生（OR＝0.96，P＝0.793）。进一步利用Logistic回归分析脂联素的3个基因多态性位点分别与BMI、肿瘤家族史之间进行交互作用，结果显示，仅有脂联素5′端侧翼区－11377C/G位点rs266729与BMI之间存在交互作用，表明两者相互作用促使CRC发病风险增高（OR＝1.16，P＝0.012），见表6。

表5 Logistic回归分析脂联素基因－基因交互作用与CRC发病风险

表6 Logistic回归分析脂联素基因－环境交互作用与CRC发病风险

3 讨 论

CRC是癌症发病和死亡顺位中位居前列的恶性肿瘤，据世界卫生组织统计，全世界每年大概有133.0万CRC新发病例，60.8万死亡病例［4］。我国是CRC高发的国家之一。CRC占我国恶性肿瘤发病的第3位，是恶性肿瘤死亡顺位第5位，给国家和人民带来沉重的经济和精神负担［5］。

肥胖、中心型肥胖及能量摄入增加，均可使CRC的发病率增高［6］。他们通过作用于胰岛素水平、胰岛素抵抗及炎性反应引起致癌效应。脂联素是脂肪细胞分泌的因子，它是胰岛素的增敏剂，并与已知CRC风险因素即肥胖、2型糖尿病及炎症相关联［7－9］。对血浆脂联素水平与CRC关联的研究得到了相矛盾的结果。Wei等［10］观察到低脂联素水平与男性CRC风险增加有关，而另外一项研究则发现两者并无关联［11］。有研究认为，脂联素基因的遗传变异有可能是导致这些矛盾结果的原因之一。研究人员已找到几个影响脂联素水平的基因变异位点，这些位点与胰岛素抵抗、肥胖及2型糖尿病相关［12］。

本病例对照研究中，选择了与胰岛素抵抗相关的脂联素的3个基因多态性位点，分别是位于5′端侧翼区－11377C/G位点：rs266729、外显子2区＋45T/G位点：rs2241766，以及内含子2区＋276G/T位点：rs1501299。本研究结果表明，个体携带rs266729的突变纯合子GG及G等位基因（GT＋GG）均可增加CRC的发病风险［OR（95%CI）：1.87（1.01～3.47）、1.63（1.14～2.32）］。同样现象在rs2241766位点亦被观察到。个体携带G等位基因（TG＋GG）者发生CRC的风险是健康人群的1.45倍（95%CI：1.02～2.06）。

脂联素基因位于染色体3q27处，由3个外显子和2个内含子组成，大概跨越了17kb区域。已鉴定出该基因是代谢综合征及2型糖尿病的敏感位点，其中包括了rs266729及rs2241766。已有几个研究证实，脂联素上述2个位点变异可引起循环脂联素水平下降，胰岛素抵抗上升，并与CRC的致癌因素之一即2型糖尿病有关［13］。脂联素是脂肪来源的蛋白质，在血清中大量存在。与其他脂肪因子不同，脂联素与肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗呈反向相关关系。脂联素亦是一种已知的胰岛素增敏激素，它能在葡萄糖代谢中起放大胰岛素的作用。因而，对于rs266729的野生型GG位点，其G等位基因（CG＋GG）及rs2241766野生型TT位点，携带TG＋GG基因型别均可能与低脂联素水平、高的胰岛素抵抗及CRC的发病风险有关。本研究与脂联素的生物学效应较吻合。最新研究表明，脂联素及其受体基因在癌症形成，尤其是导致与肥胖相关的癌症中起着关键的作用。有研究表明，脂联素基因通过调节癌变重要通路：AMPK或β－连接素－Wnt信号通路来执行其功能［14］。

肥胖导致癌症的不同致病机制是目前研究的热点。Wei等［10］认为，肥胖诱导胰岛素抵抗即高胰岛素血症，从而致使血循环胰岛素水平增高。此过程正向导致CRC的发生。最近有研究表明，肥胖者的BMI升高与CRC发病风险呈正相关关系，且与性别、肿瘤发生部位有关［15－16］。本研究表明，病例组较对照组有着更高的BMI（t＝4.68，P＝0.000）。肥胖诱导的炎性反应是脂肪组织功能受损的重要特征，它被认为在肥胖致癌过程中起着关键的作用。

尽管CRC的发病机制尚未完全阐明，许多研究表明，CRC的发生、发展是环境－基因共同作用的结果。研究发现饮食习惯西化，如大量摄入红肉、长时间静坐以及不运动等在CRC的发病过程中起着重要的作用。与健康人群不同，有肥胖、2型糖尿病的人群CRC的发病率及病死率更高，是由于糖尿病及肥胖均可导致胰岛素抵抗有关［17－18］。本研究结果表明，rs266729与BMI之间存在交互作用，表明两者相互作用促使CRC发病风险增高［OR95%CI：1.16（1.03～1.30）］。

本研究仅分析了脂联素的3个基因多态性位点，及其与BMI、肿瘤家族史之间的交互作用对CRC发病的影响，尚未能分析与胰岛素抵抗、糖尿病发病的血清学因子，这些有待课题组今后的研究进一步证实。

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