5-Azadc 和TSA对鸡Nanog基因启动活性及ESC多能性维持的影响

张亚妮，王颖洁，左其生，李 东，张 蕾，汤贝贝，连 超，毕瑜林，张文慧，李碧春

(扬州大学动物科学与技术学院 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，扬州 225009)

5-Azadc 和TSA对鸡Nanog基因启动活性及ESC多能性维持的影响

张亚妮，王颖洁，左其生，李 东，张 蕾，汤贝贝，连 超，毕瑜林，张文慧，李碧春*

(扬州大学动物科学与技术学院 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，扬州 225009)

旨在克隆如皋黄鸡Nanog基因启动子，并构建含有双荧光素酶报告基因的表达载体进行启动子活性分析，找出该基因启动子的核心调控区；探索甲基化抑制剂5-Azadc (5-Aza-2′-deoxycytidine)或曲古抑菌素 (Trichostatin A，TSA)对Nanog基因启动活性及其ESC体外培养条件下多能性维持的影响，为初步阐明Nanog基因的表达调控机制提供理论依据。PCR扩增Nanog基因不同长度片段的启动子序列，定向克隆至pGL3-basic载体和pEGFP-N1构建重组载体；将重组载体转染DF-1细胞后，48 h收集蛋白，采用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性，确定基本转录调控区；将重组载体转染DF-1细胞后添加5-Azadc或TSA对Nanog基因进行诱导表达，并通过双荧光素酶报告基因检测系统，分析其对Nanog基因启动子活性的影响。选取生长至第3代的ESC，培养基中添加最适浓度的 5-Azadc和TSA，每隔两天观察细胞，分析其对ESC体外多能性维持的影响，并对诱导至第10天的细胞进行间接免疫荧光检测。结果表明，成功构建3个片段的双荧光素酶报告基因表达载体；双荧光素酶活性检测结果显示，pGL3/1967活性最强；分别添加或者联合添加5-Azadc和TSA均可使Nanog基因的转录活性增强；……