载阿霉素的磁性微泡双模式的成像效果及其对淋巴瘤细胞毒性的研究

单永锋,王彩莲，姜藻，周守兵，郑士亚

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 肿瘤科，江苏 南京 210009)

·论 著·

载阿霉素的磁性微泡双模式的成像效果及其对淋巴瘤细胞毒性的研究

单永锋1,王彩莲2，姜藻2，周守兵1，郑士亚1

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009；2.东南大学附属中大医院 肿瘤科，江苏 南京 210009)

目的:探讨多功能高分子微泡(MPMBs)双模式成像效能及其联合超声对DLBCL弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株SU-DHL-4增殖和凋亡的影响。方法:以机械振荡法制备共载阿霉素及超顺磁性氧化铁的MPMBs，观察其体外增强B超、磁共振显影的能力；将SU-DHL-4细胞株按处理方法不同分组，CCK-8法检测各组细胞活力，吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)双染法观察细胞形态。结果：MPMBs较普通高分子微泡(PMBs)具有更好的超声、磁共振显影效果；MPMBs联合超声对DLBCL细胞增殖的抑制强于其他处理组。结论：MPMBs是一种可集治疗与超声、磁共振成像于一体的多功能造影剂。

微泡；氧化铁；多柔比星；弥漫大B细胞淋巴瘤

近年来，非霍奇金淋巴瘤(NHL)发病率不断升高，死亡率居高不下[1]，在美国其发病率位居所有肿瘤的第5位[2]。弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的NHL，约占30%～40%[3]。目前，DLBCL缺乏有效的、无创的诊断方法，以蒽环类药物为基础的联合化疗在杀伤肿瘤细胞的同时往往伴随一系列严重的毒副作用，尤其心脏毒性[4]。因此，DLBCL诊断及治疗的难题亟待解决。本研究旨在制备一种载抗瘤药物阿霉素的磁性纳米微泡，其在淋巴瘤组织的富集既可用于增强磁共振成像，有望早期、特异地诊断淋巴瘤，又能在超声作用下定点、实时释放阿霉素进行治疗，为淋巴瘤诊疗一体化理念的建立做出初步探索。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂

聚左旋乳酸(PLLA，Mw=5 000，Sigma公司)，聚乙烯醇(PVA，醇解度88%，Mw=20 000～30 000，百灵威公司)，盐酸阿霉素(深圳万乐药业有限公司)，司盘80、吐温、异丙醇皆为分析纯(上海久亿化学试剂有限公司)，油酸修饰的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒(SPIO，东南大学生物电子学国家重点实验室)，RPMI 1640培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)，CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，AO-EB双染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 主要仪器

Turrax@T 18高速搅拌器(10 G分散头，德国IKA公司)，Master Sizer2000粒径分析仪(英国 Malven公司)，高分辨透射电子显微镜(JEM-2100，日本JEOL公司)，ULTRAPLUS扫描电子显微镜(德国ZEISS公司)，KH7200DB型数控超声波清洗机(Sigma公司)，7.0 T微磁共振(德国Bruker公司)，GE医用超声诊断仪(美国GE Healthcare公司)，酶标仪(Tecan Infinite F50，瑞士Tecan公司)，荧光显微镜(IX51， 日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1MPMBs的制备 (1) 将0.5 g PLLA溶于10 ml氯仿，加入1.5 ml阿霉素溶液(含阿霉素5 mg)、适量SPIO及0.5 ml司盘80，超声波清洗机声振混匀后以IKA分散机搅拌5 min，得初级微泡溶液。(2) 将上述初级微泡溶液倒入50 ml质量分数为5%的PVA溶液中，加入0.5 ml吐温，IKA分散机搅拌30 min，形成水包油包气的复乳微泡溶液。(3) 将上述复乳微泡溶液转移到50 ml质量分数为2%的异丙醇溶液中，室温下搅拌2～3 h以完全挥散氯仿。(4) 上述溶液于4 800 r·min-1离心5 min，移去上清液，产物用超纯水重新分散，重复3次，再于1 800 r·min-1离心5 min，重复3次，移去上清液，终产物分散到25 ml超纯水中，4 ℃下密闭避光保存。

1.3.2MPMBs一般性质的测定 取一定量的样品分别行透射电镜和扫描电镜检测，了解其形态结构；Master Sizer2000粒径分析仪测定微泡粒径及分布范围。

1.3.3MPMBs药物包封率的检测 配制阿霉素标准溶液，紫外分光分度计激发波长490 nm处测定不同浓度阿霉素(x)对应的吸光值(y)，绘制标准曲线，得出回归方程；取一定量的样品离心后移去上清液，加5%盐酸乙醇溶液以破坏微泡，4 ℃下避光保存24 h后离心测上清液吸光值，代入回归方程计算被测样品携载阿霉素的量。药物包封率的计算公式如下:药物包封率(%)=WMB/Wtot×100%，其中WMB为全部样品中携载阿霉素的量，Wtot为制备过程中加入阿霉素的总量。

1.3.4体外双模式成像 (1) PMBs的制备。除了未加入SPIO及用等量的超纯水替代阿霉素溶液之外，其他步骤同上。(2) 体外超声成像。自制一个琼脂糖凝胶模型，其内平行分布3个直径约1 cm、深约2 cm的孔洞，分别注入等体积的生理盐水、PMBs溶液及MPMBs溶液，用10 L线阵探头垂直紧贴模型底部，观察三者的显影情况(超声参数:机械指数 0.4，增益 90，深度 3.0 cm)。(3) 体外磁共振成像。以3只Eppendof管分别装载2 ml的生理盐水、PMBs溶液及MPMBs溶液，在7.0 T微磁共振系统下成像，扫描参数:梯度回波序列T2*WI,矩阵256×256，成像野 4 cm×4 cm，回波12，激励次数3，扫描时间14 min 24 s，通过仪器自带软件进行图像重建，测量平均T2*弛豫值。

1.4 细胞实验

1.4.1细胞系与培养 将复苏的SU-DHL-4细胞株(德国Dsmz公司)培养于RPMI 1640完全培养液(含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各100 U·ml-1)中，在体积分数为5%CO2、37 ℃恒温培养箱内常规传代培养，适时更换培养液，所有实验均采用对数生长期细胞。

1.4.2分组干预 实验分为以下6组:对照组(A组)、单纯超声组(B组)、阿霉素组(C组)、阿霉素组+超声组(D组)、MPMBs组(E组)、MPMBs+超声组(F组)。调整细胞浓度为4×105·ml-1，每组均取 3 ml细胞悬液在6孔板中各置1孔。A、B组加PBS 3 ml，C、D组加入阿霉素PBS溶液3 ml，阿霉素终浓度为0.1 μg·ml-1，E、F组加入含有MPMBs的PBS溶液3 ml，对应的MPMBs浓度由阿霉素包封率计算而来，使其内包载的阿霉素浓度亦为0.1 μg·ml-1。B组及D、F组在加入药物或MPMBs 30 min后给予强度为1 W·cm-2的超声连续作用120 s。

1.4.3细胞活力检测 各组分别于干预后第24、48、72小时接种细胞悬液到96孔板，每组接种3个复孔，每孔100 μl，CCK-8法测定各孔吸光值。以如下公式计算各实验组细胞活力:细胞活力=实验组平均吸光值/空白对照组平均吸光值×100%。

1.4.4AO/EB双染观察细胞形态 各组分别于干预后第48小时各取1.5 ml，800 r·min-1离心5 min，弃去上清液，加PBS 50 μl重悬细胞后加入2 μl的AO/EB染液，混匀后滴1滴于载玻片上，盖上盖玻片，荧光显微镜激发波长510 nm下观察。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 MPMBs的一般性质

见图1。图1a显示透射电镜下微泡呈圆形，膜壳载铁率高；图1b显示扫描电镜下微泡呈规则圆形，粒径较均匀；图1c说明微泡粒径主要分布区间为(603.3±190.8)nm。

图1 MPMBs的透射电镜照片×150 k(a)、扫描电镜照片×13 k(b)和粒径分布(c)

2.2 MPMBs的药物包封率

阿霉素浓度-吸光值回归方程为:y=0.020 88x+0.005 1，R2=0.991 8。经计算阿霉素包封率为(25.41±4.52)%。

2.3 体外双模式成像

见图2、3。图2显示超声声像图灰度MPMBs和PMBs明显大于生理盐水组，MPMBs略高于PMBs；图3显示磁共振信号MPMBs明显低于PMBs和生理盐水组，其平均T2*弛豫值分别为生理盐水组为45.49，PMBs组为41.81，MPMBs组为18.65。

A.生理盐水; b.PMBs; c.MPMBs

图2 体外超声成像图

A.生理盐水; b.PMBs; c.MPMBs

图3 体外磁共振成像图

2.4 细胞活力检测

见图4。各组第24、48、72 小时的细胞活力，F组明显低于其他各组，A组与B组、C组与D组之间差异无统计学意义 (P>0.05)。

图4 作用于SU-DHL4细胞24、48、72 h后不同处理组细胞活力

2.5 AO/EB双染荧光显微镜下细胞形态观察

显微镜下观察显示，C组与D组之间细胞形态差异不明显，细胞密度较A、B组低，出现较多凋亡细胞；F组细胞密度最低，且多为凋亡细胞。

3 讨 论

纳米微泡不仅可用于超声造影，而且是目前最受关注的非病毒性药物载体[5]。王庆捷等[6]综述了微泡传输药物或基因的主要机制。

纳米微泡具备被动型和主动型靶向作用。就靶向肿瘤组织而言，被动型靶向[7]主要是指肿瘤组织血管的高通透性和不连续性可导致纳米微泡渗漏到血管外，继而被机体的免疫吞噬细胞吞噬而滞留；主动靶向则主要是以肿瘤细胞表面过度表达的特异性抗原表位或受体作为靶点，或籍纳米微泡的某种理化性质(如对酸碱度、温度、电荷或磁场等的敏感度)来实现。与其他肿瘤一样，淋巴瘤的发生发展、侵袭与血管生成密切相关[8-9]，而多种类型的淋巴瘤微环境中都有大量巨噬细胞的浸润[10-11]，这些都是微泡被动集聚于瘤区的基础。在本实验中，我们将SPIO装载于微泡膜壳中，在外部磁场与被动靶向的共同作用下微泡有望在肿瘤组织选择性地更多地聚集，增强其与正常组织的信号对比。

空化效应可增大细胞膜通透性，且可在细胞膜上产生大量可逆性的小孔，允许一定范围分子质量的物质自由通过，这是细胞内药物浓度得以提高的主要机制[12-13]。本研究结果表明，对SU-DHL-4细胞增值的抑制，MPMBs联合超声较单药阿霉素更高，细胞凋亡明显增多，这可能与更多的阿霉素进入细胞有关。

本研究为DLBCL的双模式成像及定点、实时治疗作出了初步的探索，MPMBs对DLBCL活体肿瘤成像和治疗的作用还有待进一步研究。此外，为实现MPMBs在瘤区更多的集聚，我们设想针对DLBCL细胞CD20抗原的单克隆抗体可借助生物素-亲和素系统偶联于微泡膜壳之上，从而增强微泡主动寻靶的能力。总之，DLBCL诊疗一体化的实现还有很多的工作要做。

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Doxorubicin loaded superparamagnetic microbubbles:dual-mode imaging and its cytotoxic effect on lymphoma cells

SHAN Yong-feng1，WANG Cai-lian2，JIANG Zao2，ZHOU Shou-bing1，ZHENG Shi-ya1

(1.SchoolofMedicine,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China；2.DepartmentofOncology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To investigate the dual-mode imaging ability of multifunctional polymer microbubbles(MPMBs)， and to observe its effect on cell proliferation and apoptosis in SU-DHL-4 cells.Methods: The MPMBs were made by mechanical vibration method. Enhancement of ultrasound (US)/magnetic resonance(MR) imaging were evaluatedinvitro. The SU-DHL-4 cells were divided into several groups according to different treatments， then the viability of cells were measured by CCK-8 assay and the morphologic changes were detected by AO/EB staining.Results: US/MR dual-mode imaging showed its better property compared with ordinary polymer microbubbles(PMBs). Besides， anti-proliferation effect of MPMBs combined US on cells was much better than other treatment groups. Conclusion: The MPMBs can be served as a mutifunctional imaging agent for treatment and imaging.

microbubbles; iron oxide; doxorubicin; diffuse large B cell lymphoma

2015-01-11

2015-02-28

国家自然科学基金资助项目(6590000065)

单永锋(1982-)，男，江苏盐城人，在读硕士研究生，主治医师。E-mail:syfeng1016@163.com

王彩莲 E-mail:wangcailian65@hotmail.com；姜藻 E-mail:jiangzao@126.com

单永锋，王彩莲，姜藻，等.载阿霉素的磁性微泡双模式的成像效果及其对淋巴瘤细胞毒性的研究[J].东南大学学报:医学版，2015，34(3)：365-368.

R313；R730.41；R733

A

1671-6264(2015)03-0365-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.007