丹参酮ⅡA磺酸钠对乳腺癌细胞株的作用及其机制研究

西安交通大学医学院第二附属医院肿瘤科(西安710004)

惠文涛 马小斌△ 昝 瑛 马一楠

△通讯作者

丹参酮ⅡA磺酸钠对乳腺癌细胞株的作用及其机制研究

西安交通大学医学院第二附属医院肿瘤科(西安710004)

惠文涛 马小斌△昝 瑛 马一楠

目的：研究丹参酮ⅡA磺酸钠对雌激素受体(ER)、表皮生长因子受体-2(HER-2)表达不同的人乳腺癌细胞株(MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231)的作用，并探讨其作用机制。方法：以0.025～0.8μg/ml不同浓度丹参酮ⅡA磺酸钠处理MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231细胞，MTT法测定不同浓度丹参酮ⅡA磺酸钠对三种乳腺癌细胞株细胞增殖的抑制作用，流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期。结果：丹参酮ⅡA磺酸钠处理后，MCF-7细胞增殖活性降低，凋亡指数升高，细胞周期分布改变，G0/G1期细胞数增加，S期和G2/M期细胞数减少；SKBR-3和MDA-MB-231细胞增殖活性、细胞凋亡及细胞周期无明显改变。结论：丹参酮ⅡA磺酸钠对ER阳性乳腺癌细胞具有生长抑制作用,其作用机制可能与凋亡诱导、细胞周期阻滞有关；丹参酮ⅡA磺酸钠对ER阴性、HER-2阳性和ER阴性、HER-2阴性乳腺癌细胞无明显生长抑制作用。

丹参酮ⅡA是从中药丹参中提取的有效脂溶性成分[1]，丹参酮ⅡA磺酸钠是其溶于水的剂型。研究表明，丹参酮ⅡA对多种肿瘤细胞具有杀伤和促进凋亡作用[2-3]。有报道丹参酮ⅡA对ER阳性乳腺癌细胞具有生长抑制的作用[4],但其作用机制,及对ER、HER-2表达不同的乳腺癌细胞作用差异尚不清楚。本实验通过观察丹参酮ⅡA磺酸钠对MCF-7、SKBR-3和MDA-MB-231细胞株的增殖、细胞凋亡和细胞周期分布的影响，探讨丹参酮ⅡA对人ER、HER-2表达不同的乳腺癌细胞的作用及可能作用机制。

材料和方法

1 主要材料和试剂 MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231细胞株，购自西安交通大学第二附属医院中心实验室细胞库,DMEM高糖培养基(美国 Hyclone公司)，PBS粉剂(京中杉生物有限公司)，胎牛血清(美国 Hyclone公司)，胰酶粉剂(美国 Hyclone公司)，EDTA粉剂(美国 Hyclone公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)(美国 Sigma公司)，二甲基亚砜DMSO(美国 Sigma公司),碘化丙啶(Propidiumiodide, PI) (美国 Sigma公司)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(珠海健康元生物医药公司)。丹参酮ⅡA磺酸钠(上海第一生化药业有限公司)，使用时用含血清的培养基配置至所需浓度，现用现配。

2 方 法

2.1 细胞培养和传代：人乳腺癌细胞株MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231用含10%灭活小牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养液，在37℃、50ml/L CO2、饱和湿度孵箱培养。当细胞80%～90%汇合时，用含有0.04%EDTA的胰酶消化，以1∶1传代，48 h换液，2～3d再次传代，细胞呈指数生长时进行分组实验。

2.2 MTT检测细胞增殖抑制率：选取对数生长期的MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231细胞，经胰酶消化、台盼蓝染色后在血球计数板上计数，确保活细胞在97%以上。调整细胞浓度为每孔1×105个/ml(每孔100 μl)，加入96孔培养板内，置于37℃、5% CO2孵箱中培养。将细胞进行同步化处理，并分实验组、培养基对照组、DMSO对照组，每组3个复孔。次日更换培养基，实验组分别更换为含0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μg/ml丹参酮ⅡA磺酸钠的培养基，培养板放回孵箱培养72 h，取出培养板，每孔加入MTT (5mg/ml)20μl，继续培养4 h。吸出上清液，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，在平板摇床摇10 min，用酶标仪测490 nm 波长处每孔的吸光度(A值)。

细胞生长抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%，实验重复3次。

2.3 AnnexinV-FITC/PI双标记染色检测细胞凋亡：取处于对数生长期的细胞，常规消化，制成单细胞悬液，以1×105个/ml细胞浓度接种于6孔板中。次日起更换为含0.8μg/ml丹参酮ⅡA磺酸钠的培养基，72h后离心收集细胞。按AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒提供的方法进行染色，取5×105个/ml细胞悬液1ml，离心后加入500μl的1×Banding Buffer，再依次加入5μl Annexin V-FITC，10μl碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀，室温(20～25℃)避光孵育10min，流式细胞仪测定细胞凋亡率。实验重复3次。

2.4 流式细胞仪检测细胞周期：取处于对数生长期的细胞，常规消化，制成单细胞悬液，以1×105个/ml细胞浓度接种于6孔板中。次日起更换为含0.8μg/ml丹参酮ⅡA磺酸钠的培养基，72h后离心收集细胞。取5×105个/ml细胞悬液2ml，离心后弃去上清液，PBS洗涤2次×10min，用遇冷的75%酒精固定，4℃过夜；离心弃去酒精，PBS洗涤2次×5min；加PI染液100μl，4℃避光染色30min；流式细胞仪检测细胞周期分布。实验重复3次。

2.5 统计学方法:采用SPSS 13.0统计学软件，数据用均数±标准差描述，采用单样本均数的t检验分析各组数据均值的大小，采用方差分析对各组数据进行比较分析，采用SNK-q检验进行各组数据两两之间的比较分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 MTT法测定丹参酮ⅡA磺酸钠对细胞增殖的影响 MTT法测定不同浓度丹参酮ⅡA磺酸钠作用于乳腺癌MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231细胞72h对细胞增殖的抑制作用，结果见图1。

1.1 不同浓度丹参酮ⅡA磺酸钠对MCF-7细胞抑瘤率差异无统计学意义(F=0.034，P>0.05)；不同浓度丹参酮ⅡA磺酸钠对SKBR-3细胞抑瘤率差异无统计学意义(F=0.098，P>0.05)；不同浓度丹参酮ⅡA磺酸钠对MDA-MB-231细胞抑瘤率差异无统计学意义(F=0.068，P>0.05)。

1.2 0.8μg/ml丹参酮ⅡA磺酸钠对MCF-7细胞抑瘤率为0.1037±0.0287，明显大于0(t=10.848，P<0.01)；0.8μg/ml丹参酮ⅡA磺酸钠对SKBR-3细胞抑瘤率为0.0291±0.0727，与0相比差异无统计学意义(t=1.202，P>0.05)；0.8μg/ml丹参酮ⅡA磺酸钠对SKBR-3细胞抑瘤率为0.0034±0.0524，与0相比差异无统计学意义(t=0.198，P>0.05)。

图1 丹参酮ⅡA磺酸钠对乳腺癌细胞增值抑制作用

2 丹参酮ⅡA磺酸钠对乳腺癌细胞凋亡的影响 0.8μg/ml丹参酮ⅡA磺酸钠处理72h后，MCF-7细胞实验组凋亡率为5.16%，与对照组(1.33%)相比差异有统计学意义(P<0.05)；SKBR-3细胞实验组凋亡率为2.64%，与对照组(2.51%)相比差异没有统计学意义(P>0.05)；MDA-MB-231细胞实验组凋亡率为3.98%，与对照组(3.84%)相比差异没有统计学意义(P>0.05)，见图2。

3 丹参酮ⅡA磺酸钠对乳腺癌细胞周期的影响 0.8μg/ml丹参酮ⅡA处理MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231细胞72 h后,MCF-7细胞G0/G1期细胞数增加,S期和G2/M期细胞数减少，差异有统计学意义(P<0.05)；SKBR-3、MDA-MB-231细胞G0/G1期，S期和G2/M期细胞数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

讨 论

目前乳腺癌的治疗是以手术为主，辅以化疗、放疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等的综合治疗。并且ER、PR、HER-2表达不同的乳腺癌预后及对化疗药物的敏感性不同[5-6]。中药作为中国的传统医药，是乳腺癌治疗的另一个手段，具有副作用少、容易耐受的特点，适合作为乳腺癌患者，尤其是不能耐受化疗的晚期乳腺癌患者的辅助治疗[7]。丹参酮ⅡA是从中药丹参根部提取的脂溶性有效成分,既往研究表明丹参酮ⅡA对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用和凋亡诱导作用,具有抑制人ER阳性乳腺癌细胞生长[8]，但其作用机制及对ER阴性和HER-2阳性的乳腺癌细胞的作用尚不清楚。

本研究用丹参酮ⅡA磺酸钠处理ER、PR、HER-2表达不同的乳腺癌细胞(MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231)，检测其抑制作用。结果表明，丹参酮ⅡA磺酸钠对MCF-7细胞增殖有明显的抑制作用，0.025～0.8μg/ml浓度的抑瘤率大小无明显差异，丹参酮ⅡA磺酸钠对KBR-3、MDA-MB-231的作用微弱，提示丹参酮ⅡA磺酸钠对ER阳性乳腺癌具有抑制作用；对ER阴性、HER-2阳性和ER阴性、HER-2阴性的乳腺癌无明显抑制作用。丹参酮ⅡA磺酸钠处理MCF-7细胞后,细胞凋亡率升高，G0/G1期细胞比例增加，提示丹参酮ⅡA磺酸钠对MCF-7细胞的抑制作用可能与诱导凋亡及细胞周期阻滞有关[9]。

刘永惠等[10]报道，经蛋白酶联免疫法检测发现，丹参酮能有效抑制突变型P53和mdm2的表达，证实了其在抑制肿瘤生产、转移中具有重要作用。CyclinD1 为细胞周期G1/ S 期的调控点, 其过表达能缩短G1期, 促使细胞提前进入S 期, 引起细胞生长失控、转化和癌变[10],丹参酮ⅡA磺酸钠对人ER阳性乳腺癌细胞具有生长抑制作用,其作用机制可能与细胞周期阻滞、诱导凋亡有关。对ER阴性、HER-2阳性和ER阴性、HER-2阴性的乳腺癌无明显抑制作用，提示丹参酮ⅡA磺酸钠可能通过雌激素受体发挥作用，而对雌激素受体阴性乳腺癌细胞未能发挥作用，本实验仅是观察到了这一现象，进一步的分子机制及其与细胞周期的关系需要进一步的实验研究。

[1] 郝文慧，赵文文，陈修平.丹参酮类抗肿瘤作用与机制研究进展[J].中国药理学通报,2014 ,30( 8) : 1041-1044.

[2] Chen J，Shi DY，Liu SL，etal． Tanshinone ⅡA induces growth inhibition and apoptosis in gastric cancer in vitro and in vivo[J]．Oncol Rep，2012，27( 2) : 523-8．

[3] Zhao P W，Niu J Z，Wang J F，etal． Research on the inhibitoryeffect tanshinone ⅡA on breast cancer cell proliferation[J]． Chin Pharmacol Bull， 2010，26( 7) : 903-6．

[4] Xu Changliang,Xi Tao, Anti-migration and anti-angiogenic effects of tanshiononenIIA on breast cancer cell MDA-MB-435[J].Journal of Crmaceutical University, 2009,40(6):565-570.

[5] 陈 曦，吴晶晶，张 妍，等.三阴性乳腺癌临床病理特征及与药物敏感度蛋白的相关性[J].肿瘤防治研究,2014,41(5)：439-442.

[6] 张晓丽,邵雪辉,杨翠军,等.常用乳腺癌化疗方案与ER、PR及C-erbB-2表达的相关性[J].江苏医药,2012，37(4)：424-426.

[7] 孙 飞，潘迎英，包玉花,等.中药汤剂联合化疗治疗乳腺癌临床疗效系统评价[J].辽宁中医药大学学报，2014,16(7):156-159.

[8] 赵丕文,牛建昭,王继峰,等.丹参酮ⅡA抗乳腺癌细胞增殖作用研究[J].中国药理学通报，2010,26(7):903-906.

[9] 王爱红，王明全，庞秋霞,等.番茄红素对乳腺癌MDA-MB-231 细胞周期和增殖的影响[J].陕西医学杂志，2008,37(11):1482-1484.

[10] 刘永惠，郭少贤，常 靖,等.丹参酮对血瘀证乳腺癌P53基因、mdm2基因表达的影响[J].陕西中医，2011,32(12):1666-1667.

(收稿：2015-03-03)

Growth inhibition effect of tanshinoneⅡA on human breast cancer cell lines and its mechanism

Department of Oncology, The Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710004)

Hui Wentao Ma Xiaobin Zan Ying et al

Objective:To investigate the growth inhibition effect of tanshinoneⅡA on human breast cancer cell lines and its mechanism.Methods :MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231 cells were cultured with different concentration (0.025～0.8μmol/L) of tanshinoneⅡA in vitro. MTT assay was used for analyzing the growth inhibitory effect of tanshinoneⅡA in human breast cancer cell lines. The apoptosis rate and cell cycle distribution was detected by flow cytometric analysis. Results:TanshinoneⅡA could inhibit effectively MCF-7 cells . Flow cytometric analysis showed apoptosis ratio of MCF-7 rised, G0/G1 phase cell populations increase ,and S，G2/M phase cell populations decrease in 0.8μmol/L concentrations of tanshinoneⅡA group after 72h．TanshinoneⅡA could not inhibit effectively SKBR-3、MDA-MB-231 cells．Conclusions:TanshinoneⅡA could inhibit effectively human breast cancer cell with estrogen receptor positive. The mechanism for the effect may be associated with induction of apoptosis and cell cycle arrest. TanshinoneⅡA can not inhibit Human Breast Cancer Cell with Estrogen Receptor Negative.

TanshinoneⅡA Breast neoplasms/immunology Receptors,Estrogen Receptors,Epidermal growth factor

丹参酮IIA 乳腺肿瘤/免疫学 受体，雌激素 受体，表皮生长因子

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.004