艾拉莫德(T-614)对类风湿关节炎患者外周血单个核细胞凋亡和IL-8趋化因子免疫调节作用实验研究*

西安市第五医院检验科 (西安 710082 )

郑 杰 王晓元△ 刘 丹▲ 杨良勤 陈庆平

艾拉莫德(T-614)对类风湿关节炎患者外周血单个核细胞凋亡和IL-8趋化因子免疫调节作用实验研究*

西安市第五医院检验科 (西安 710082 )

郑 杰 王晓元△刘 丹▲杨良勤 陈庆平

目的：检测艾拉莫德(T-614)对类风湿关节炎(RA)外周血单个核细胞(PBMC)诱导凋亡作用及IL-8细胞因子水平变化，探讨T-614对RA治疗的免疫机制。方法：收集风湿免疫科诊断明确的活动期RA患者，采集全血，处理收集PBMC。制备T-614，使用不同剂量T-614，为高剂量组、中等剂量组和低剂量组与PBMC共培养，孵育1h、3h，通过流式细胞仪检测PBMC凋亡，并收集上清检测IL-8水平。结果：T-614与PBMC共孵育培养，T-614高剂量、中剂量与空白对照组PBMC凋亡率为1h:12.30±2.45%、8.23±2.29%和4.71±2.01%，3h：25.47±4.19%、13.39±3.80%和7.88±2.71%，各组比较使用T-614低剂量，中等剂量与PBMC共孵育培养24h收集上清，ELISA法检测IL-8水平，T-614中、低剂量与空白对照组分别为48.91±8.33μg/ml、125.31±20.02 μg/ml和155.36±22.15μg/ml。结论：随着T-614浓度升高，对PBMC细胞凋亡成剂量依赖性趋势，同时降低细胞分泌因子IL-8水平。免疫调控诱导 PBMC凋亡、降低趋化因子IL-8水平可能是T-614治疗RA的重要机制。

类风湿性关节炎( Rheumatoid arthritis, RA) 是一种进行性、侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫疾病，在我国的患病率为0.2%～0.4%。艾拉莫德(Iguratimod，T-614)一种新型开发的抗风湿药物，治疗RA具有高效、不良反应少等特点，作为抗风湿二线药在关节炎的治疗中逐步体现出较佳的疗效，但其确切的治疗机制尚不清楚。本研究通过检测T-614对类风湿关节炎(RA)外周血单个核细胞(PBMC)诱导凋亡作用，以及IL-8细胞因子水平变化，探讨T-614对RA治疗的免疫作用机制。

资料与方法

1 一般资料 收集2013年10月至2014年2月在西安市第五医院就诊的RA患者12例，男性2例，女性10例，年龄20～65岁，病程2月至10年。诊断均符合1987年美国风湿病协会(ACR)修订的诊断分类标准，且未使用过艾拉莫德治疗。患者DAS28评分≥3.2分，为病情活动期，患者均签署知情同意书。

2 主要试剂和仪器 Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒，购自美国Biolegend公司，人淋巴细胞分离液购自MP. Biomedicals公司，RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，Human IL-8 Immunoassay ELISA试剂盒，购自北京盛基瀚森科技有限公司，艾拉莫德(T-614)由先声药业公司惠赠，FACS Calibur流式细胞仪产自美国Becton Dickinson公司，酶标仪为美国BioTek公司。

3 方 法 艾拉莫德(T-614)(先声药业公司惠赠)每片25mg，粉碎后，溶解在2ml的DMSO中，震荡20min后，过40μm筛网，配置成10mg/ml，分装EP管中，细胞培养应用DMEM液稀释10倍使用微孔过滤器过滤分装使用。

3.1 细胞分组处理：患者静脉血10ml入肝素抗凝管中，采用密度梯度分离法，分离PBMC后，用RPMI 1640培养液(含10%的胎牛血清)调整细胞数至2×105/ml，接种于24孔培养板，每孔1ml细胞混悬液，5%CO2培养箱孵育。将每例PBMC设7个孔进行处理：空白对照组(无药物干预)，T-614高剂量组(500μg/ml)、中等剂量组(50mg/ml)，共培养分别为1h和3h，检测PBMC凋亡。T-614中等剂量组(50μg/ml)组、T-614低剂量组(5μg/ml)组培养24h，染色进行CD3+T 细胞IFN-γ表达检测及收集上清检测IL-8水平。

3.2 流式细胞术检测PBMC的凋亡：分别收集培养箱孵育1h、3h及24h后的培养细胞，吹打混匀，将细胞混悬液收集在流式管里，1200r/min，离心8min，收集培养上清液，置于-80℃冰箱备ELISA检测。细胞制备：加入PBS液，1200r/min，离心5min，洗涤2次，弃上清。加入1×Annexin-Binding Buffer液100μl，将细胞混匀，在暗室内冰上操作。每管加4μl Annexin V-FITC和1μl的PI工作液(1∶4稀释)。室温，孵育15min。加1×Annexin-Binding Buffer液150μl，轻柔混匀，1h内上机检测样本。

3.3 ELISA检测IL-8水平：根据Human IL-8 Immunoassay ELISA试剂盒说明书进行操作，对收集的细胞培养上清液进行检测：以空白孔设为零值，以450nm为检测波长，以630nm为参考波长，测吸光值。绘制标准曲线,计算出样品中IL-8的含量。

结 果

1 T-614干预PBMC细胞形态学改变 T-614不同剂量干预PBMC，对1h、3h干预的PBMC进行台盼蓝染色，镜下可见正常PBMC圆形状态良好，包膜清晰，台盼蓝染色呈兰色染色为凋亡坏死细胞，可见细胞大小不等，破碎坏死等见图1。

图1 与T-614共培养后PBMC台盼蓝染色[A:正常对照组;B:1h空白对照组(未加T-614)；C：1h中等剂量组(T-614 50μg/ml);D:1h高剂量组(T-614 50μg/ml);E:3h中等剂量组(T-614 50μg/ml)；F：3h高剂量组(T-614 500μg/ml)。×100倍]

2 流式细胞仪检测PBMC凋亡结果 共孵育1h和3h，凋亡细胞百分比空白对照组与T-614高、中等剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。T614高与中等剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05),见图2、表1。

3 细胞培养上清液检测 ELISA检测上清IL-8水平，T-614中等和低剂量组与对照组比较，IL-8水平明显减低(P<0.05)，见表2。

图2 各组PBMC凋亡细胞流式细胞仪检测结果

表2 共培养24h上清各组IL-8结果的比较 (±s)

讨 论

RA是一种慢性的全身自身免疫性病，目前国内外尚无特异的有效治疗方法。艾拉莫德(T-614)为新型的口服的小分子DMARDs药物，在RA疾病中的治疗作用越来越受到重视[1]。多项研究表明，由于RA患者自身免疫功能紊乱，自身淋巴细胞过度增生激活本文采用RA的PBMC进行研究，结果显示，T-614可以诱导RA患者PBMC凋亡，且呈剂量依赖性，提示T-614对患者淋巴细胞的免疫调节功能。从而减轻诱导疾病加重的全身及关节局部炎症反应，改变了病程，与以往的临床治疗疗效观察结果相符[2]。

活化的淋巴细胞分泌IL-8等是重要的免疫炎症因子，在RA的发病中起到非常重要的作用，IL-8是多形核中性粒细胞有效的趋化因子，能增加人单核细胞炎性细胞因子的释放，趋化包括TNF-、IL-6、IL-1β等细胞因子，可以进一步介导炎症反应，激活粒细胞发生变形、游走和聚集，在炎症部位产生浸润作用。本研究得出，随着T-614剂量增加，PBMC上清的IL-8水平逐步下降，提示了T-614有抑制PBMC分泌IL-8的作用，且呈浓度依赖性，故考虑经T-614治疗后，患者血清中IL-8水平可能减低，炎性趋化能力减弱，具有减轻患者全身关节炎症反应的治疗作用。上述研究结果提示，T-614治疗RA的免疫抑制可能为诱导了活动期RA患者PBMCs的凋亡，抑制细胞因子IL-8分泌，而达到改善症状，控制病情的作用。

[1] Mucke HAM. Iguratimod: A new disease-modifying antirheumatic drug[J]. Drugs of Today,2012, 48(9): 577.

[2] 刘 丹，陈 妤，丁汉飞，等.艾拉莫德(T-614)在类风湿关节炎基础实验与临床疗效的研究进展[J].中国新药杂志，2013，22(9):1052-1055.

(收稿：2015-01-13)

The effects of Iguratimod(T-614) on the apoptosis of peripheral blood mononuclear cells and the secretion of IL-8 in rheumatoid arthritis patients

Department of Rheumatology, The Fifth Hospital of Xi’an (Xi'an 710082)

Zheng Jie Wang Xiaoyuan Liu Dan et al

Objective:To observe the effect of Iguratimod (T-614) on the apoptosis of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), the expression of IL-8 in rheumatoid arthritis (RA) patients, and to explore the possible mechanism of T-614 in treating RA. Methods: 12 patients were diagnosed with RA referred to the Department of Rheumatology. PBMCs were prepared from 12 patients in active stage of RA and treated with T-614 at different concentrations (lower dose: 5 μg/ml; Moderate dose: 50 μg/ml; Higher dose: 500μg/ml ) for 1h and 3h Flow cytometry (FCM) were performed to examine the apoptosis of PBMCs.the secretion of IL-8 in the culture supernatant of treatment group and control group was tested by ELISA after treated with T-614 for 24h. Results: We found that iguratimod effectively induced apoptosis in PBMCs. The apoptosis rates of PBMCs treated with T-614 for 1h were T-614 8.23±2.29% for 50 μg/ml and 12.30±2.54% for 500 μg/ml. The apoptosis rates of PBMCs treated with T-614 for 3h were 13.39±3.80% for 50 μg/ml and 25.30±4.19% for 500 μg/ml. Levels of IL-8 in the culture supernatant of T-614 treated group and control group were tested by ELISA. Iguratimod effectively inhibit IL-8 prodcution, 48.91±8.33 μg/ml for T-614 50 μg/ml, 125.31±20.02μg/ml for T-614 5 μg/ml and 155.36±22.15 μg/ml for the control group (treated without T-614).Conclusions: The results suggest that T-614 induced the apoptosis of PBMCs and inhibited the secretion of IL-8 in peripheral blood. It might be the possible mechanism of the effect of T-614 in treatment of RA.

Arthritis rheumatoid/immunology Apoptosis Monocytes Chemotactic factor IL-8

*陕西省卫生厅科研资助项目(2012D25)

甘肃省科技厅资助项目(144FKCA060)

关节炎，类风湿/免疫学 细胞凋亡 单核细胞 趋化因子类 白细胞介素-8

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.007

△兰州大学第二医院

▲通讯作者