抗弓形虫水通道蛋白多肽抗体的制备及鉴定

张佳凤，郝文波，肖 斌，廖小青，罗树红

抗弓形虫水通道蛋白多肽抗体的制备及鉴定

张佳凤，郝文波，肖 斌，廖小青，罗树红

目的 研制抗弓形虫水通道蛋白(TgAQP)的特异性多肽抗体，并应用于检测弓形虫ME49株中水通道蛋白的表达和亚细胞定位。方法 根据TgAQP氨基酸序列设计B细胞抗原多肽，并将合成的多肽与KLH偶联作为免疫原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体，通过ELISA、Western blot和免疫荧光的方法对所得抗体进行鉴定。结果 选定并合成抗原表位多肽,与KLH偶联作为免疫原制备多克隆抗体；经ELISA测定其多肽抗体效价达1∶40 000; Western blot表明制备的抗体能特异地识别天然弓形虫中29.9 kDa处的条带，与预测的TgAQP相对分子量大小相符；免疫荧光检测到抗血清识别的蛋白定位于弓形虫胞质中。结论 制备了抗弓形虫水通道蛋白多肽的多克隆抗体，为进一步研究弓形虫水通道蛋白的生物学功能和代谢特点奠定了基础。

弓形虫；水通道蛋白；多肽抗体；亚细胞定位

水通道蛋白(Aquaporins,AQP)，亦称水孔蛋白，自1992年Agre等[1]于红细胞膜发现第一个水通道蛋白AQP1以来，目前在哺乳动物细胞膜上已发现13种[2]水通道蛋白，并分别介导不同类型细胞膜的跨膜水转运。水通道蛋白是与水通透有关的细胞膜转运蛋白[3]，广泛存在于动物、植物及微生物中。刚地弓形虫(Toxoplasmagondii,Tg)水通道蛋白(TgAQP)属于小分子疏水性内在膜蛋白家族，可通过渗透压梯度作用实现弓形虫体内水分子的跨膜运输[4]。现有研究表明弓形虫AQP蛋白与植物TIP蛋白高度同源，均拥有参与水通道蛋白孔口形成的典型NPA基序[5],并与恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum,pf)的水通道蛋白亦均是一种水/甘油转运通道[6]。水通道蛋白参与了许多重要的生理病理学过程，不仅与水的转运相关，也是吸收和释放葡萄糖及甘油等小分子溶质所必需的转运载体[7-9]。细胞毒性化合物如羟基脲和氢氧化锑可通过水通道蛋白进入并杀死寄生虫，TgAQP可能为弓形虫病的诊断和治疗提供新的靶标[10]，具有重要的临床意义。本研究通过人工设计并合成抗原表位多肽，将其偶联载体蛋白作为免疫原制备多克隆抗体，为进一步研究弓形虫水通道蛋白的生物学功能和代谢特点提供有力工具。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 弓形虫虫株 弓形虫虫株选用首个已测序的刚地弓形虫ME49株(II型虫株)，由南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所保存。

1.1.2 主要试剂 合成多肽由广州瑞博奥生物科技有限公司合成；马来酰亚胺活化的BSA、KLH偶联试剂盒(MBK1)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司；蛋白质Marker购自Fermentas公司；PVDF膜购自Bio-Rad公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体购自Bioworld公司；DAPI购自碧云天；Alexa Fluor 488羊抗兔IgG购自Invitrogen。

1.1.3 实验动物 健康25～30 g昆明小鼠(SPF级)及健康8周龄雄性新西兰大耳白兔(SPF级)均由南方医科大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 多肽的设计及合成 根据NCBI中刚地弓形虫与同源性高的恶性疟原虫[11]的水通道蛋白氨基酸序列，使用Immune Epitope Database(IEDB)软件和BCPREDS Server 1.0软件对TgAQP进行B细胞线性抗原表位预测。再使用在线工具TMHMM Server v 2.0分析其跨膜区[12]，综合SDSC Biology Workbench BOXSHADE方法得到的同源性比对结果，选取一段具有高度抗原性的非跨膜区保守序列。并委托广州瑞博奥生物科技有限公司进行合成。

1.2.2 多肽的偶联及免疫原的制备 使用MBK1试剂盒，通过马来酰亚胺法将合成的多肽一部分与BSA偶联制备包被原，另一部分与KLH偶联制备免疫原，并将其溶于预先灭菌的PBS中,以等体积的比例分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂进行充分乳化作为免疫原[13]。

1.2.3 多克隆抗体的制备 与弗氏完全佐剂乳化的免疫原按0.2 mg每只采用皮下多点注射方法免疫健康雄性新西兰大耳白兔。按0.1 mg每只以弗氏不完全佐剂为乳化剂每两周加强免疫1次；免疫3次后，用偶联BSA多肽为包被原，间接ELISA测定抗体的效价>1∶40 000,继续加强免疫2次后，测得效价>1∶80 000[14]。采用颈动脉放血并分离以获得抗血清[15]。

1.2.4 多克隆抗体的纯化 使用Protein-G亲和层析法纯化所得的抗血清：用结合缓冲液稀释后于0.45 μm滤膜过滤，加样到IgG亲和层析柱，流速1 mL/min至基线，用洗脱缓冲液(100 mmol/L甘氨酸-HCl，pH 2.5)洗脱后，收集洗脱峰为纯化的多克隆抗体，SDS-PAGE分析纯化的效果[16]。

1.2.5 多克隆抗体效价测定 使用ELISA法检测抗血清效价：每孔100 ng包被原于4 ℃包被过夜，次日1% BSA-PBS封闭1 h；加入倍比稀释的抗血清作为一抗孵育2 h，同时以等体积免疫前兔血清和含5%脱脂奶粉的PBS作为阴性对照和空白对照。加入1∶10 000稀释的HRP标记羊抗兔IgG作为二抗孵育1 h，TMB显色。用酶联免疫检测仪测定450 nm处的吸光度值。

1.2.6 刚地弓形虫速殖子的体内培养及纯化 将液氮内冻存的刚地弓形虫ME49株于37 ℃水浴复苏，感染昆明鼠后7～10 d发病，于腹腔注射5 mL/只生理盐水后回抽腹水的方法进行弓形虫的体内培养。再以800 g离心10 min，弃上清，加生理盐水洗涤沉淀3次后重悬纯化刚地弓形虫速殖子[17]。

1.2.7 Western blot检测天然弓形虫水通道蛋白 取刚地弓形虫速殖子加入等体积2×Loading Buffer裂解，水浴煮沸10 min，离心取上清进行Western blot分析。分别以免疫前收集的兔血清和纯化的兔抗血清作为一抗孵育2 h。HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗孵育1 h，ECL法显色。

1.2.8 免疫荧光试验分析TgAQP的亚细胞定位 取500 μL刚地弓形虫速殖子涂布于激光共聚焦专用培养皿孔中，于室温晾干。加入4%多聚甲醛固定5 min，加入0.25% Triton X-100室温透化10 min；用1% BSA PBST室温封闭30 min；分别加入1∶1 000稀释的兔多抗或免疫前兔血清作一抗室温孵育1 h，加入用1∶1 000稀释的Alexa Fluor 488羊抗兔IgG作二抗室温避光孵育1.5 h，最后加入1∶1 000稀释的DAPI染核10 min，PBS洗涤1次于激光共聚焦显微镜下观察荧光。

2 结 果

2.1 B细胞线性表位预测 B细胞线性抗原表位预测结果如图1所示：IEDB软件选择界值为0.350时显示TgAQP存在6个B细胞线性表位，其中第7～27位氨基酸的抗原表位评分最高。BCPREDS Server 1.0软件中BCPred Predictions方法得到3个表位评分中第8～23位氨基酸的抗原表位评分最高；而AAP Predictions方法得到8个表位评分中包括第9～24位氨基酸的7条多肽其抗原表位评分较高。综合两种工具的表位评分发现TgAQP蛋白包含第8～24位氨基酸的多肽其抗原评分均较高。

A:IEDB software; B:BCPREDS Server 1.0 software (b1:used the BCPred Predictions, b2:used AAP Predictions).

2.2 多肽的设计、合成及免疫原制备 其跨膜区及同源性比对结果如图2所示：TMHMM软件分析TgAQP蛋白含有6个跨膜区，而同源性比对结果中第9～19位氨基酸高度同源。最终设计多肽的氨基酸序列为：CGGSEGGGELGGDRERDS，后17个氨基酸来自于TgAQP第8～24位氨基酸残基，N-端的C(半胱氨酸)为额外添加，以利于与载体蛋白的偶联[18]。委托广州瑞博奥生物科技有限公司合成多肽后偶联载体蛋白，用等体积弗氏完全佐剂乳化制备免疫原。

A:the transmembrane structure of the TgAQP predicted by TMHMM software;

2.3 多克隆抗体的纯化及效价 检测兔抗抗血清纯化后进行SDS-PAGE检测结果如图3所示：制备抗血清的纯化效果较好，在53 kDa处有1条特异性条带，与抗体IgG重链的分子量相符；在22 kDa处有条带，与抗体IgG轻链的分子量较为相符。

2.4 检测多克隆抗体的效价及其对弓形虫水通道

1:Protein marker; 2:Purified polyclonal antibody.

蛋白的识别 纯化后抗血清抗体效价结果如图4A所示：采用间接ELISA法测定纯化后抗体效价达1∶40 000。将制备的多克隆抗体通过Western blot方法应用于弓形虫水通道蛋白的检测，结果如图4B所示：在29.9 kDa处有1条特异性条带，与TgAQP预测的分子量相符。

2.5 免疫荧光试验分析TgAQP的亚细胞定位 免疫荧光检测TgAQP的亚细胞定位结果如图5所示：通过激光共聚焦显微镜观察可见，绿色荧光散在分布于刚地弓形虫速殖子的胞质中，Merge后与蓝色荧光无重合；而使用免疫前兔血清的阴性对照的结果显示无绿色荧光。结果说明了TgAQP散在分布于弓形虫胞质中，未见于胞核。

A:The titer of anti-TgAQP antibody was about 1∶40 000 by ELISA, the OD450 value of negative control is 0.047; B:Identification of TgAQP by Western-blot (1:Rabbit anti-TgAQP antibody; 2:The pre-immune serum of rabbit).

图4 多克隆抗体效价的检测及其对弓形虫水通道蛋白的识别

Fig.4 Antibody titer of the purified polyclonal antibody and identification of TgAQP by Western-blot

A:The pre-immune serum of rabbit; B:Rabbit anti-TgAQP antibody. The bright field (BF) shows the form oftoxoplasmatachyzoite, and the green fluorescence is TgAQP, while DAPI displays the nucleus oftoxoplasma.

图5 免疫荧光分析TgAQP在弓形虫速殖子内的亚细胞定位

Fig.5 Subcellular localization of TgAQP inT.gondiitachyzoites by immunofluorescence assays

3 讨 论

自发现弓形虫以来，由刚地弓形虫引起人兽共患的弓形虫病呈世界性分布，对公共卫生安全和畜牧业造成严重的危害[19]。近年来，随着器官移植、医源性免疫移植和艾滋病患者的增多,弓形虫病的发病率逐年呈现上升趋势，因此开展对弓形虫的研究、控制其感染和流行具有重要的意义[20]。目前弓形虫病的临床表现复杂且缺乏特异的症状，临床诊断使用的是血清免疫学方法[21]。同时，真正商品化的疫苗有Buxton等研发的用于绵羊免疫的疫苗，而适用于人的疫苗更为少见[22]。而弓形虫水通道蛋白在细胞吸附、免疫调节以及毒力衰减方面有重要作用，这一功能对弓形虫的生命活动至关重要[23]。为了解水通道蛋白在弓形虫的入侵机制、毒力基础、发育周期的作用，本实验研制针对弓形虫TgAQP的抗体，为深人研究TgAQP蛋白的生物学功能和代谢特点提供必要的试验材料。

本研究制备蛋白多肽抗体的关键在于多肽片段的设计与选择，通过软件预测和分析蛋白的结构特征与抗原表位，选择三维结构无法暴露且抗原性高的非跨膜区。通过与恶性疟原虫水通道蛋白同源性比较，选择同源性较高、长度在15～40个氨基酸且具有稳定构象的B细胞线性表位[24]。与其他制备抗原的方法相比，人工合成多肽抗原具有以下优点：避免菌体杂蛋白的污染；周期短；成本较低；操作简单且应用范围广[25]。免疫新西兰大耳白兔获得的多克隆抗体效价高达1∶40 000。Western-blot分析刚地弓形虫合成的天然水通道蛋白可检测到约29.9 kDa处的特异性条带。间接免疫荧光分析TgAQP散在分布于细胞质中，未见于细胞核中。综上所述,我们制备的兔抗TgAQP多克隆抗体具有与其抗原特异性结合的特征，并可应用于免疫印迹和免疫荧光实验,为深人研究弓形虫水通道蛋白的生物学功能和代谢特点奠定基础。

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Preparation and identification of anti-TgAQP peptide antibody

ZHANG Jia-feng,HAO Wen-bo,XIAO Bing,LIAO Xiao-qing,LUO Shu-hong

(InstituteofAntibodyEngineering,CollegeofBiotechnology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

In this study, we intended to prepare anti-Toxoplasmagondiiaquaporin (TgAQP) peptide antibody which was used to the application in the detection of the aquaporin expression and its subcellular localization ofToxoplasmagondii(T.gondii) ME49 strain. The B cell peptide antigen was designed based on the TgAQP amino acids sequence. After the peptide antigen was conjugated to the KLH, the fusion antigen was injected into New Zealand rabbits to prepare polyclonal antibody, followed by identification of ELISA, Western-blotting and immunofluorescence assays. The ELISA showed that the titer of anti-TgAQP antibody was about 1∶40 000. Western blotting revealed the specific affinity of the antigen to polyclonal antibody at 29.9 kDa proteinT.gondii. The protein detected by the indirect immunofluorescence assays was distributed in the cytoplasm of the parasite. Thus far, the anti-TgAQP polyclonal antibody was successfully prepared, providing a useful tool for further study of biological function and metabolic characteristics of TgAQP.

Toxoplasmagondii; aquaporin; peptide antibody; subcellular localization

Luo Shu-hong, Email:sluo815@gmail.com

国家自然科学基金(No.81171608)

罗树红,Email:sluo815@gmail.com

南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所，广州 510515

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.002

R382.5

A

1002-2694(2015)10-0903-05

2015-04-08；

2015-07-31

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81171608)