消化道菌群及检测方法研究进展

刘建钗，刘彦威，白福娟，刘 月

（河北工程大学农学院，河北省禽病工程研究中心，河北邯郸056021）

消化道微生物种类多、数量大，构成一个复杂的微生态系统，被认为是体外“器官”［1］。消化道微生态菌群质和量与动物品种、个体及消化部位有关，同时受年龄、饮食和健康状况影响。微生物与宿主之间互相作用、互相依赖，共同形成的一个动态平衡的微生态系统，对消化道起到重要的调节作用［2-3］。长期以来，研究消化道菌群一直依靠细菌培养，由于消化道细菌绝大部分不能用现有的培养方法获得。近年来，随分子生物学的发展，建立许多新的方法，使得深入而全面的了解微生物群落结构、完善微生物的分类鉴定系统成为可能。

1 消化道菌群的作用

消化道微生物是维持机体稳态的组成部分。消化道原藉微生物通过种间竞争，有效地消除肠道病原微生物，不仅是抗感染重要原因，还能阻止病原微生物致癌酶的作用，消除有害化合物的合成。肠道生态系统参与消化酶和维生素的合成，营养肠上皮细胞产生短链脂肪酸和聚酰胺，或增强黏蛋白的合成能力，维持肠上皮细胞完整性。与上层的黏液，共同形成一道重要屏障，防止微生物侵入或过敏原吸收。肠道细菌影响胃肠道免疫功能，通过原位微生物调节，促进对抗原更快和更有效的免疫应答。肠道微生物维持健康状态必不可少的，固有菌群失调被认为是许多的疾病的原因。在生态系统中，菌群质和量破坏会降低免疫功能，增加真菌定植风险和胃-肠道紊乱。通常认为异常菌群是肠道疾病炎症性的原因。因此，肠道微生物复合体作为一个整体，其鉴定方法引起越来越多的兴趣，对胃肠道中的菌群定性和定量分析，为全面了解肠道微生物在体内各要素间的相互作用，对了解许多疾病的根源是必要的，也有助于开发新的疗法［4-6］。

2 消化道微生物种类和分布

消化道中存在着数量庞大的微生物，这群微生物依靠人和动物消化道生活，同时帮助寄主完成多种生理生化功能。消化道微生物涉及17科50属1 000多种细菌，细胞总数量达100万亿，这个数目相当于10倍的体细胞和生殖细胞的数目［3］。对消化道菌群有明显影响的因素包括分娩、饲养方式、饲喂、药物、应激及侵入性细菌的治疗等。微生物的质和量随生长过程改变而变化。在分娩时，胎儿定植的微生物来自母体生殖道和产房微环境。发现母乳喂养的婴儿双歧杆菌和拟杆菌的细菌百分比特别高，而牛奶喂养促进大肠埃希菌和梭状芽胞杆菌的生长。一个人比较成熟的肠道微生态是建立需要3年左右，7年最具典型。以后随年龄增长，拟杆菌和双歧杆显著降低，而梭状芽胞杆菌、杆菌和梭杆菌明显增加，后者能够产生潜在的致癌物质［7］。

每段消化道内均有微生物分布，但其种类是不同的，主要是兼性好氧菌或兼性厌氧菌。口腔和咽部有大量不同的氧需细菌群，在舌后咽壁基部黏滑罗斯菌最多，链球菌定植牙菌斑。食道和胃的微生物随着吞咽食物不同而异。在肠道99%是厌氧菌。胃pH低，不利于大多数细菌的繁殖，胃是微生物定植较低的器官（＜103个／mL胃内容物），其微生物大多数为厌氧菌（葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和乳杆菌属），严格厌氧微生物通常是零星存在的。在小肠内细菌数量增加，小肠起始段定植环境与胃差异不大；小肠后段生态环境与结肠类似，微生物的数量为106CFU／g～107CFU／g粪便，大多是厌氧菌（梭状芽胞杆菌属、双歧杆菌属等）。大肠蠕动缓慢，pH接近中性，适于大多数细菌环境，大肠菌群数量大、种类多（10CFU／g～10CFU／g粪便），具有特殊兼性和专性厌氧细菌。优势菌群（约占总数30%～40%）包括拟杆菌、双歧杆菌和梭状芽胞杆菌，次优势菌为肠球菌、大肠埃希菌和乳酸杆菌。其他大肠微生物在动物个体之间存在差异，有宿主特异性［7-8］。

研究发现消化道菌群在消化腔的分布不同。乳杆菌紧靠黏膜分布，黏附在上皮形成细菌生物膜；大肠埃希菌、肠球菌等好氧菌和兼性好氧菌贴近肠腔分布，与肠腔菌群没有明显差异；在两者之间分布粪杆菌、消化链球菌和优杆菌等厌氧菌［7，9］。

3 肠道细菌的检测方法

3.1 传统分离培养方法

用传统方法在培养基上可获得单菌落。有些培养基还可用于分离、计数和鉴定。在培养基添加某些物质，可显示鉴定意义特征。例如，大肠埃希菌代谢产生β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶，产生特异颜色菌落，只需数小时就可鉴定。为了解细菌对宿主的影响，也需要进行微生物培养，但现有培养基无法满足特殊微生物需要，一种解决方案就是卫星培养。如流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌一起培养，葡萄球菌能合成Ⅴ因子释放于培养基中，从而促进流感嗜血杆菌的生长。尽管这样，肠道内92.70%微生物无法培养（肠道菌有1 822种，其中1 689种为不可培养细菌）［7-8］，主要是无法提供合适培养环境（包括温度、pH、渗透压和氧含量等）。常规培养不可能对肠道生态系统全面分析，需要进行新研究方法的探索。

3.2 变性梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。一般凝胶电泳，迁移决定于分子大小和电荷，能够把不同长度DNA片段区分开，但不能区分相同长度DNA片段。DGGE是在一般凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺），从而能够把相同长度，但序列不同的DNA片段区分开。Muyzer等［10］1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。此后10年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展为研究微生物群落结构的主要方法之一，已用于人、猪、牛、鸡、鼠和狗等胃肠道微生物多样性研究。Simpson J M 等［11］首次用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳分析猪肠道微生物，发现不同年龄猪和不同个体间肠道细菌种群存在差异。Kocherginskaya S A 等［12］则率先研究了瘤胃细菌的结构。Lan P T等［13］应用16SrDNA序列分析，对鸡盲肠中存在的细菌进行了鉴定。用同样的方法，张恒业等对断奶幼兔的肠道细菌定植情况进行了研究，发现微生态制剂改善肠道菌群定植。程翔等［14］发现在奶牛饲粮添加芽胞杆菌、乳酸菌、酵母菌等益生菌，使肠道菌群多样性明显高于对照组，证实微生态制剂具有调节奶牛肠道菌群平衡的作用。DGGE具有检测速度快、重复性好、分辨率高等优点，其局限是敏感性，只能检测到1%的微生物菌落，会忽略数量少、但功能重要的细菌。

3.3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）技术是由Applied Biosystems公司于1996年首先推出的，它的原理是将合适的荧光基团加入PCR反应体系中，根据荧光信号的积累来对PCR的进程实时监测，未知模板的定量分析通过标准曲线来进行。近年来，real-time PCR已开始用于肠道微生态菌群分析［15］。Matsuki T 等［16］通 过 realtime PCR研究了肠双歧杆菌分布，发现青春双歧杆菌（B.adolescentis）、链状双歧杆菌（B.catenulatum）和长链双歧杆菌（B.longum）是主要双歧杆菌。Ereqat S等［17］基于目的基因设计了特异性引物，结合real-time PCR细菌可被鉴定到不同株的水平。丁俊荣等［18］采用real-time PCR方法，对肠道脱硫弧菌的数量进行定量分析，结果显示，其中息肉（2.9×106CFU／mL）和溃疡性结肠炎（1.2×106CFU／mL）人群肠道中脱硫弧菌的数量明显高于健康人群（6.8×105CFU／mL）。黄怡等［19］研究了新生仔猪口服屎肠球菌对其肠道菌群组成的影响，发现口服屎肠球菌改善哺乳期仔猪肠道菌群组成，促进肠道健康。易园骊等［20对肠道内菌群进行了real-time PCR研究，在兔的粪便中细菌数量分别为大肠埃希菌（11.48±1.09）拷贝数／克湿粪、乳酸杆菌（4.94±0.95）拷贝数／克湿粪、双歧杆菌属（4.07±0.97）拷贝数／克湿粪，且大肠埃希菌数量与非酒精性脂肪性肝病有关。王晓霞等［21］用real-time PCR研究无患子皂甙粉对瘤胃微生态影响，发现无患子皂甙粉显著降低了产琥珀酸丝状杆菌的数量，显著提高了溶纤维丁酸弧菌的数量。与常规的PCR技术相比，real-time PCR技术具有较高的灵敏性和特异性，定量较准确，重复性好，污染少，自动化程度较高等特点，但是定量也有其缺点，如不能检测扩增产物的大小，需要摸索优化的条件等。

3.4 荧光原位杂交技术

荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）将带有荧光标记的寡核苷酸探针直接与固定在载玻片上的细胞进行杂交，固定过程中要使短的探针渗透到细胞内的核酸，用荧光显微镜即可观察到带有杂交荧光标记探针的细胞。目前FISH技术在环境样品中微生物多样性，污水处理相关微生物多样性，内共生微生物多样性及医学微生物口腔、肠胃、呼吸道菌群多样性研究中得到了广泛的应用。美国研究人员用寡核苷酸作探针检测粪便中肠道菌群。Wang R F等［22］改良基于16SrRNA基因序列为探针，可检测20种肠道菌，如大肠埃希菌、肠球菌、嗜酸乳杆菌等。采用通用引物，Fprausnitzii等用3个40核苷酸探针，每个有针对特异性细菌，调查的结果表明，该方法能有效检测粪便样本中占主导地位的人肠内细菌，可同时检测几十个菌种［2］。Jonach B等［23］用 FISH 方法，观察了腹泻和健康仔猪肠菌群情况，发现两组猪中，大肠埃希菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌没有差异，首次在腹泻猪肠道发现肠球菌，推测黏附在肠黏膜的大肠埃希菌和肠球菌可能参与仔猪腹泻发病机制。FISH技术可在显微镜直接观察，周期短，能迅速得到结果，特异性好，定位准确，但FISH技术的应用要受到环境样品微生物的生理状态的影响，如芽胞、放线菌及休眠时期细胞的细胞膜通透性降低，以及细菌在繁殖过程中荧光基因可能发生变化，从而影响群试验结果准确性［24］。

总之，目前研究肠道微生物菌群的方法分为传统分离培养方法和基因分析方法，这两种方法各有优点和缺点。分离培养最大的缺陷是无法检测庞大的肠道微生物，用这种方法，只能够检测生长在培养基上的细菌，肠道微生物的检测，分离培养仍然是基本和广泛使用的方法。然而，整个胃肠道的微生物准确的定量和定性调查，基因测试是必需的。由于基因分析不仅可以识别数量庞大的新微生物，而且确定在胃肠道不同部位的优势菌群。因此，这两种技术结合将成为了解肠道细菌生态系统的一个关键因素。

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