一株紫色非硫光合细菌的分离鉴定和培养特性研究

林燕玲，刘杰凤，周 天，陈俊任，李 婷，丘盛情

(广东石油化工学院，广东茂名 525000)



一株紫色非硫光合细菌的分离鉴定和培养特性研究

林燕玲，刘杰凤*，周 天，陈俊任，李 婷，丘盛情

(广东石油化工学院，广东茂名 525000)

紫色非硫细菌；光合细菌；沼泽红假单胞菌；培养特性

紫色非硫细菌(Purple nonsulfer bacteria)是红螺菌科光合细菌的通称，因富含不同类型的类胡萝卜素，细胞培养液呈紫色、红色或棕色，故称为紫色细菌。这类光合细菌曾被认为不能利用硫化物作为电子供体进行光合作用，所以称它们为非硫紫色细菌。这类细菌的大多数尚可以利用低浓度的硫化物[1-2]。

紫色非硫细菌在黑暗好氧、光照厌氧等条件下能以不同的代谢方式，以有机物为光合作用的供氢体兼碳源，因而具有较强的分解和去除有机物的生理特性，其中不少种能耐受高浓度有机物，故在处理高浓度有机废水中有着独特的优点和广泛的应用前途[3-6]；同时，这类菌体细胞富含氨基酸种类全面的蛋白质、辅酶Q和B族维生素等多种生理活性物质，因而成为增加动物营养、促进生长和增强防病抗病能力等功能的重要微生物资源[7-10]。近年来，由紫色非硫细菌固氮酶所催化的光合放氢研究也成为微生物制氢生产清洁能源的研究热点[11-13]。

1 材料与方法

1.1 材料 供试泥样采自茂名市周边养殖场。

1.2 培养基

1.2.1 富集培养基[14]。组成为：NH4Cl 1.0 g，NaHCO31.0 g，K2HPO40.2 g，CH3COONa 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 1.0 g，生长因子10 ml，蒸馏水980 ml，微量元素液10 ml，pH 7.0。其中，生长因子组成为：维生素B1 0.01 mg、乙尼克丁酸1.0 mg、对氨基苯甲酸1.0 mg、生物素0.01 mg,蒸馏水定容至100 ml；将NaHCO3配制成浓度5%水溶液；微量元素液组成为：FeCl3·6H2O 0.5 mg、CuSO4·5H2O 0.005 mg、H3BO40.1 mg、MnCl2·4H2O 0.005 mg、ZnSO4·7H2O 0.1 mg、Co(NO3)2·6H2O 0.05 mg，蒸馏水定容至100 ml。将以上3种溶液均经0.22 μm滤膜过滤除菌。

1.2.2 分离培养基。组成为：乙酸钠2.0 g、谷氨酸2.0 g、KH2PO40.5 g、K2HPO40.5 g、NH4Cl 1.0 g、MgSO40.5 g、NaCl 1.0 g，用饮用井水定容至1 000 ml，pH 7.0。固体培养基按1.5%添加琼脂。

1.2.3 液体培养基。组成为：乙酸钠2.0 g、酵母膏2.0 g、KH2PO40.5 g、K2HPO40.5 g、NH4Cl 1.0 g、MgSO40.5 g、NaCl 1.0 g，用饮用井水定容至1 000 ml，pH 7.0～7.4。

1.3 紫色非硫细菌的富集分离 将20 ml池塘底泥悬浮液加入250 ml 透明塑料瓶中，加满富集培养基，液面注入液体石蜡，隔绝空气，置于30 ℃、60 W白炽灯光照下培养10～15 d，待液体培养物呈现红色，转移至新配制的富集培养基中富集培养，重复2～3次。取摇匀的富集培养物100 μl，涂布于培养皿中，加入 20 ml冷却至 40～45 ℃ 的固体分离培养基，待培养基凝固后，再在上面倒55～60 ℃ 的溶化态固体石蜡，制成固体石蜡双层培养平板[15]，置于强度为 60 W 的白炽灯下照射培养10 d(30 ℃±4 ℃)。揭去将覆盖在上层的固体石蜡，挑取粉红色至红色单菌落,倍比稀释后以同样方法进行纯化，纯种穿刺接种培养，保藏备用。

1.4 紫色非硫细菌的扩大培养 菌种活化容器为150 mm×15 mm试管，扩培容器为250 ml 透明塑料瓶(紫外线杀菌)，培养容器装满灭菌液体培养基后，按15%(108个/ml，V/V)接种量接种，30 ℃、60 W白炽灯光照下微氧培养，至培养液深红色，OD660≥1.5。

1.5 生理特性试验 菌株的生理生化特性鉴定参照文献[16]所述方法进行。

1.6 测定方法 活菌体、离体光合色素吸收光谱检测参考文献[5]进行，即培养液经5 000 r/min离心得活菌体，用浓度60%蔗糖溶液制成菌体悬液；浓度60%蔗糖菌悬液以超声波碎破，得红色无细胞抽提液。2种悬液均用TU-180型紫外-可见光分光光度计扫描，波长范围200～900 nm。

1.7 紫色非硫光合细菌的鉴定 分离菌的培养特性、菌落及菌体形态、色素吸收光谱等分析参照文献[16-17]。

2 结果与分析

2.1 紫色非硫光合细菌的分离纯化 通过经典红螺菌培养基的固体石蜡双层培养平板法分离、纯化，得到多株光合细菌。通过扩大培养试验观察，发现其中一株菌的活性最佳，易于成活，故取该活性最好菌进行后续试验，并将该株菌命名为 GB-1。

在固体培养基中厌氧光照培养，GB-1的菌落成圆形，表面低凸，边缘完整，湿润，有光泽，呈紫红色，半透明且易挑起(图1)。在液体培养基中微好氧光照培养，GB-1菌液为深红色，菌体均匀分布于菌液中。在无光照条件下培养，菌体虽能生长，但培养物几乎无色。

2.2 紫色非硫光合细菌的鉴定

2.2.1 菌株的形态特征。GB-1为革兰氏阴性菌，菌体形态多样，多为杆状，稍有弯曲甚至弧状，大小不均，单个细菌的直径为(0.5～1.0) μm×(1.2～4.5) μm，有的长达10 μm,没有形成芽孢，以形成分裂管的出芽方式繁殖，能明显见到呈哑铃状的菌体(图2)。这些特征与沼泽红假单孢菌相似。

2.2.2 活细胞及离体光合色素光吸收特征。由图3可知，该菌含有细菌叶绿素 a(375～ 382、585～ 596、798～ 806 nm处的吸收峰)及类胡萝卜素(448～ 454、480、508～ 512 nm处的吸收峰)。活细胞的光吸收特征进一步表明它们属于紫色非硫细菌。

2.2.3 生理生化特征。由表 1 可知，该菌能利用部分小分子有机物作为碳源和供氢体生长，属于能进行光能异养生长的光合细菌。它在以Na2S为唯一光合供氢体的培养基中微弱生长。

查对《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)，GB-1符合红螺菌科红假单胞菌属的种属特性，并且与文献[5]报道的沼泽红假单胞菌特征相似，故初步鉴定该菌为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。

表1 GB-1的生理生化特性

注：+为阳性，-为阴性。

2.3 紫色非硫光合细菌GB-1的生长特性 光照、氧、pH及盐度是影响紫色非硫光合细菌生长的重要因素。图4～6显示了GB-1的生长特性。

由图4可知，白炽灯光微氧环境最适宜GB-1生长，测得此条件下的温度为32～35 ℃。

由图5可知，光合细菌GB-1适宜在低NaCl浓度(<1%)下生长。随着NaCl浓度的增加，GB-1生长速率的减慢幅度较大，当NaCl浓度为5%时生长已很微弱。

由图6可知，GB-1在弱碱性条件下的生长速率比酸性条件下要快，最适生长pH范围为8.0～9.0。

3 结论

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Isolation, Identification and Cultural Character of a Strain of Purple Nonsulfur Photosynthetic Bacteria

LIN Yan-ling, LIU Jie-feng*, ZHOU Tian et al

(Guangdong University of Petrochemical Technology, Maoming, Guangdong 525000)

[Objective]The research aimed to obtain a new bacteria source of functional photosynthetic bacteria.[Method]A strain of purple nonsulfur photosynthetic bacteria GB-1 was isolated and purified from the sediment of fishpond in Maoming suburbs. The classification and identification of purple nonsulfur photosynthetic bacteria GB-1 was carried out by the observation of cell morphology, the cell coloring matter absorption spectrum determination and the study of physiological and biochemical characteristics. Meanwhile，the cultural character of the strain GB-1 was subsequently investigated．[Result]The strain GB-1 was identified asRhodopseudomonaspalustris. The optimum conditions for its growth were studied as follows: the best carbon source was a small molecule organic acid, growth temperature was 32-35 ℃, pH was 8-9, NaCl concentration was less than 1%, and the condition of illumination was incandescent light bulb and micro-aerobic. [Conclusion] Halotolerated ability of GB-1 were 5%. After the cultivation for 7 d，the removal rates for ammonia nitrogen and nitrite by the strain GB-1 was up to 57.71% and 47.45%, respectively. It appeared broad application prospects in the treatment of eutrophic water．

Purple nonsulfer bacteria; Photosynthetic bacteria;Rhodopseudomonaspalustris; Cultural character

广东省海洋渔业科技推广专项基金项目(A201101B03，A201201C03)；国家级大学生科技创新训练项目(234066)。

林燕玲(1992- )，女，广东广州人，本科生，专业：生物技术。*通讯作者，教授，硕士，从事应用微生物方面的研究。

2015-04-21

S-03

A

0517-6611(2015)17-005-04