丽格海棠组织培养技术研究

曾佑炜，李进进，吕镇城

(1.广东轻工职业技术学院环境工程系，广东广州 510300；2.惠州学院生命科学系，广东惠州 516001)



丽格海棠组织培养技术研究

曾佑炜1，李进进1，吕镇城2

(1.广东轻工职业技术学院环境工程系，广东广州 510300；2.惠州学院生命科学系，广东惠州 516001)

[目的]通过组织培养方法，筛选丽格海棠不定芽诱导、继代培养和生根培养的最佳培养基，为丽格海棠的快速繁殖提供参考。[方法]采用丽格海棠叶片、叶柄、茎段为外植体进行不定芽诱导、继代及生根培养。[结果]MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L是诱导叶片愈伤组织培养的最佳激素配比；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L是诱导叶柄的最佳激素配比； MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L是诱导茎段愈伤组织培养的最佳激素配比；MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L是诱导丽格海棠继代培养的最佳激素配比；1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L是诱导丽格海棠生根培养的最佳激素配比，叶片更适宜应用于组织培养。[结论]为丽格海棠织培养快速繁殖和遗传转化提供理论依据。

丽格海棠；组织培养；最佳配比

丽格海棠(Begoniaelalior)为秋海棠科秋海棠属多年生草本花卉，为球根海棠和野生秋海棠杂交选育而成[1]。其花期长、花朵大、花色丰富、鲜艳，深受消费者的欢迎，多用于家庭几案、桌饰、窗饰、宾馆大堂、客厅、餐厅和会议室摆放，是冬春季节美化室内环境的重要花卉。丽格海棠通常无种子，一般采用扦插、组织培养进行繁殖[2-3]。扦插繁殖主要以茎插和叶插为主，但繁殖速度慢，且非常容易烂根，很难满足市场需求。笔者采用丽格海棠不同部位，对其进行丛生芽诱导、继代增殖和生根培养比较研究，以建立一套完整的组织培养体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试材料为盆栽丽格海棠。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制。采用MS培养基，pH 5.8,在121～126 ℃灭菌15～20 min。蔗糖30 g/L，卡拉胶9.0 g/L。

诱导培养基：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L；MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L；MS+6-PA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；MS+6-BA 1.5 mg/L+2-4,D 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L；MS+6-BA 1.5 mg/L+2-4,D 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.6 mg/L;MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L;MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L；MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.4 mg/L；MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L+腺嘌呤8 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L。

继代培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

壮苗培养基：以继代配方为基础，大量元素减半，糖类减半，不添加激素。

生根培养基：1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L；1/2MS+NAA 0.3 mg/L；1/2MS+NAA 0.6 mg/L；3/4MS+IBA 0.3 mg/L+KT 0.15 mg/L。

1.2.2 培养条件。温度22～26 ℃，光照强度1 200～1 500 lx，光照周期12～14 h/d。

1.2.3 外植体的消毒及处理。取丽格海棠的成熟和幼嫩叶片、叶柄、茎段，将外植体放置于密封培养瓶中，在4 ℃的冰箱中冷藏12～24 h备用，将处理后的材料中放于少量洗衣液(0.5%)的水中浸泡并摇匀，30 s后把浸泡液倒掉，放于流水下冲洗10 min。在超净工作台上先用2%次氯酸钠浸泡摇匀8～ 10 min(叶片8 min；其余外植体10 min)，最后用无菌水冲洗4 次，每次3 min左右。再用0.1%升汞浸泡摇匀消毒8～10 min，将消毒好的外植体置于经过高温灭菌后的无菌水空瓶中并盖好盖子，接种时先用消毒后的镊子夹出放在经高温灭菌的牛皮纸上，然后用消毒过的解剖刀或刀片对外植体进行切割，叶片切成1 cm2左右大小，叶柄、茎段切成1 cm左右，接种于培养基上。

外植体培养30和60 d后分别统计死亡率和分化率。污染率=污染数/接种总数×100%。死亡率=死亡外植体数/有效外植体总数(即接种数-污染数)×100%。分化率=分化外植体数/有效外植体总数×100%。

1.2.4 不同外植体分化情况比较。选取丽格海棠的叶片、叶柄、茎段( 有叶腋生长点)为外植体，观察统计污染率、死亡率和分化率。

1.2.5 继代培养。取诱导分化出的丛生芽，接种到培养基上，每瓶接种3～4团丛生芽，然后放入培养室中培养，30 d后观察其继代生长情况。

1.2.6 壮苗培养。将符合壮苗的小型继代苗植株，按无菌操作要求接种到壮苗配方培养基上，每瓶3～5个小植株苗，然后放入培养室中培养，30 d后观察其生长情况。

1.2.7 生根培养。选择生长健壮且高3～5 cm的增殖苗，将其分成单苗接入生根培养基中进行生根培养，30 d 后调查其生根率和根系生长状况。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对外植体愈伤组织形成与分化的影响 由表1可知，综合考虑叶片培养污染率、60 d死亡率和60 d分化率，叶片适宜培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L，虽然其分化率只有34.8%，但由于污染率低，总体表现最好；叶柄适宜培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L，此培养条件下污染率为20.0%,60 d死亡率和60 d分化率分别达到33.3%和66.7%；茎段适宜培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L。一般30 d分化率高的60 d分化率也较高，但叶柄培养基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L，30 d分化率只有8.3%，而60 d分化率却达到66.7%。综合来看，适宜叶片分化的激素配比为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L，适宜叶柄分化的激素配比为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L，适宜茎段分化的激素配比为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L。

同时，由于叶片在培养过程中，污染率相对较低，整体分化率相对较高更适宜应用于离体培养。

叶片诱导形成愈伤组织的情况见图1，茎段和叶柄诱导产生芽和愈伤组织的情况见图2。

表1 不同培养基对外植体愈伤组织形成与分化的影响 %

注：接种数均为30个。

2.2 继代培养 将诱导培养的芽苗切割后转入增殖培养基中，培养30 d后的增殖结果表明，MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L培养基30 d后新的丛芽长高长大，叶子膨胀，苗茎长高变粗，形成小植株，生长状况旺盛(图3a)。虽然MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基也有部分开始长出新的丛芽，但丛芽不明显，局部发黄，呈玻璃化现象(图3b)，因此，在后期的壮苗培养过程中，以此培养基作为壮苗培养的基础培养基。

2.3 壮苗培养 30 d后壮苗结果(图3c)表明，经过壮苗，植株明显变得更加粗壮，为生根培养奠定基础。

2.4 生根培养 由表2可知，不同培养基都可以诱导生根，NAA 浓度过高时，根较细长，降低NAA 浓度，添加6-BA 时，根系生长茂密、粗壮，因此，诱导丽格海棠瓶苗生根较为理想的培养基为1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L(图3d、e、f)。

3 结论与讨论

在组织培养中，生长素能引起完整组织中细胞扩展，其生理作用是促进细胞和器官的伸长和细胞分裂，4 ℃的低温预处理有利于叶片、叶柄和茎段外植体的诱导培养。不同外植体其分化途径不同，叶片和叶柄经愈伤组织诱导成芽，茎段则可直接进行芽的诱导，虽然缩短了培养时间，但愈伤组织诱导的丛生芽较多。如将茎段和叶柄进行4 ℃下冷藏48 h前处理,茎段和叶柄在初代培养中液体溢出量少，污染率和死亡率低，且分化出芽所需时间短，可能因为低温处理时,一方面低温可能在一定程度上抑制微生物的生长，另一方面，在冷藏阶段，茎或叶柄切段的分泌物己有部分外渗，因而培养阶段分泌物量减少，对外植体的浸泡及毒害作用也就减轻，从而降低了初代培养的死亡率和污染率，大大提高了组培效率。

表2 不同培养基对生根的影响

初代培养的目的是建立无菌的植物组织培养离体生长体系，因此其成功与否是组织培养能否进行的关键环节。由于受植物遗传特性、生理生态特性及外界环境条件等的影响，不同植物启动其离体器官或组织脱分化，进而再分化建立组织培养无性系所需的条件不同。全能性是任何植物活细胞都具有的一个特性，但在一个物种中可能并非所有的品种，在一个属中也可能并非所有的种都能同样地表达这个特性。在由同一个植株切取的外植体中，全能性的表达与否还可能因外植体的生理状态而不同。在快速繁殖中，重要的是选择最佳状态的组织或器官，且这些组织或器官能够尽快诱导形态发生，这是实现快速繁殖的关键。秋海棠属植物组织培养中，叶片、叶柄、花梗、花瓣以及嫩茎均可作为离体培养对象[4]，但最常用的外植体类型是叶片和叶柄，因为叶片和叶柄资源丰富，取材容易。四季秋海棠、铁十字秋海棠、莲叶秋海棠、突脉秋海棠均有以叶片作为外植体进行离体培养的报道[5-8]；蟆叶秋海棠及其杂种的组织培养中，绝大多数以叶柄作为外植体，其次是叶片[4]；而球根秋海棠和丽格海棠杂种群，多以叶片作为外植体实现植株再生，其次是叶柄[4]。钟十传等[9]研究表明，秋海棠属植物中的球根秋海棠“金正日花”组织培养中嫩叶是适宜的外植体类型。陈琼珍等[10]在铁十字秋海棠组培快速繁殖研究中，采用卷成漏斗状尚未展开的嫩叶作为离体培养的外植体，启动培养效果好。但该试验中，中度成熟器官无论从成活率还是分化率上均优于幼嫩器官，因为后者在表面消毒过程中极易死亡，从而初代培养成功率很低。秋海棠属植物组织培养中以茎段作为外植体的报道较少，可能是茎段含水量较高不易成活。

该研究对叶、叶柄和茎段外植体的死亡情况和分化情况进行比较表明，经愈伤组织诱导途径的诱导系数远大于直接芽诱导途径，但愈伤组织诱导途径诱导时间较长，一般为20～60 d，芽诱导途径较快，20 d左右分化。茎段作为外植体进行离体培养时，可不经过愈伤组织阶段直接诱导出芽，其分化出芽所需时间短，约20 d即开始分化，芽色嫩绿；而叶片、叶柄和茎段诱导形成愈伤组织的时间约50 d，虽然反应时间慢，但产生的愈伤组织团多，诱导丛生芽的数量也多，生长状况更加良好。

该试验通过对丽格海棠叶片、叶柄和茎段离体培养技术的研究，建立了一套较完善的组培快繁体系。MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L是诱导叶片愈伤组织培养的最佳激素配比；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+腺嘌呤8 mg/L是诱导叶柄和愈伤组织培养的最佳激素配比，2,4-D 在丽格海棠组织培养过程中，能够很好地促进愈伤组织的形成；MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L是诱导茎段愈伤组织的最佳激素配比；MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L是继代培养的最佳激素配比，1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L是生根培养的最佳激素配比。该研究为丽格海棠工业化生产提供一定的理论依据。

[1] 文锦芬,邓明华,施卫省,等.丽格海棠离体培养植株再生影响因素的研究[J].北方园艺，2006(2):110-111.

[2] 韩富军.丽格海棠及其栽培技术[J].北方园艺，2008(2):176-177.

[3] 韩超，方正.外植体和激素对丽格海棠组培不定芽分化的影响[J].河北农业大学学报，2005，28(3):38-41.

[4] 刘艳芬,樊慧敏.秋海棠属植物组织培养研究进展[J].河北林业科技,2002(2):34-35.

[5] 颜宁,杨小凤.四季秋海棠的离体培养及植株再生[J].邵阳学院学报：自然科学版，2004，1(1):107-109.

[6] 侯占铭,王振兴,满都拉，等.铁十字秋海棠和蟆叶秋海棠的组织培养与快速繁殖 [J].内蒙古师大学报：自然科学(汉文)版，2001，30(3):260-262.

[7] 韩阳,吴丽馥,侯潇，等.莲叶海棠组织培养及快速无性繁殖[J].辽宁大学学报：自然科学版，1999，26(2):179-181.

[8] 唐凤鸾,黄宁珍,蒋能,等.突脉秋海棠组织培养及快速繁殖研究[J].西南农业学报,2013(2):762-765.

[9] 钟十传,杜启兰.球根秋海棠“金正日花”的组织培养技术[J].北方园艺，2003(1):54.

[10] 陈琼珍,胡永,温佑兴.铁十字秋海棠组培快速繁殖研究[J].广东园艺,1996(4):25-26.

Study on Tissue Culture Technology ofBegoniaelalior

ZENG You-wei1, LI Jin-jin1, LV Zhen-cheng2

(1. Department of Environment-engineering, Guangdong Light Industry Technical College, Guangzhou, Guangdong 510300; 2. Department of Life Science, Huizhou University, Huizhou, Guangdong 516007)

[Objective] The objective of this study was to develop an efficient system for the regeneration ofBegoniaelaliorby investigating the factors influencing callus and shoot induction. [Method] Leaves, petioles and stems ofBegoniaelaliorwere used as explants for adventitious bud induction, subculture and rooting. [Result] The optimum medium for the differentiation and elongation for leaves and petioles or stems was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+adenine 8 mg/L, MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+adenine 8 mg/L, MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L respectively; The optimum medium for the secondary and the rooting culture was MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L and 1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L, respectively. [Conclusion] The rapid propagation system ofBegoniaelaliorwas established in this study, which could provide theoretical evidence for the rapid propagation and genetic transformation ofBegoniaelalior.

Begoniaelalior; Tissue culture; Optimum medium

广东轻工职业技术学院自然科学基金项目(KJ201312)；广东省青年创新人才项目(2014KQNCX214)。

曾佑炜(1973-)，男，福建宁化人，副教授，博士，从事植物天然产物方面的研究。

2015-04-16

S 682.2+9

A

0517-6611(2015)17-020-05