黄菠萝嫩茎离体培养再生体系的建立

王新天， 王新宇， 李晓萍， 王红艳， 王伶俐， 郭志新， 张成婧， 韩学慧， 刘 欣

(1.双辽市林木种苗管理站，吉林四平 136400;2.双辽市郑家屯街林业站，吉林四平 136400;3.吉林省林业勘察设计研究院,吉林长春 130033)



黄菠萝嫩茎离体培养再生体系的建立

王新天1， 王新宇2， 李晓萍1， 王红艳1， 王伶俐1， 郭志新1， 张成婧1， 韩学慧1， 刘 欣3

(1.双辽市林木种苗管理站，吉林四平 136400;2.双辽市郑家屯街林业站，吉林四平 136400;3.吉林省林业勘察设计研究院,吉林长春 130033)

[目的]优化黄菠萝离体培养再生体系。[方法]以黄菠萝带腋芽的嫩茎为外植体，采用正交设计研究其离体培养再生体系。[结果] 诱导黄菠萝的最佳初代培养基是MS+1.5 mg/L 6-BA +0.06 mg/L NAA +20 g/L蔗糖，继代培养的最佳培养基组合是MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA，最佳生根培养基组合是1/2MS+0.4 mg/LNAA +30 g/L蔗糖。[结论]以黄菠萝带腋芽的嫩茎为外植体，采用正交设计研究其离体培养和植株再生技术方法是可行的。

黄菠萝；组织培养；再生体系；正交设计

黄菠萝(PhellodendronamurenseRupr.)，属芸香科黄檗属落叶阔叶乔木，是国家级重点保护植物。目前对黄菠萝的研究较少，一般偏重于采种[1]、育苗[2]、嫩枝扦插[3]、药用价值[4]方面的研究。近年来，黄菠萝资源日益减少，甚至在某些地区濒临灭绝。黄菠萝组织培养方面已有报道,如郭勇[5]用黄菠萝茎段诱导愈伤组织和不定芽进而再生植株，愈伤组织诱导率为82%，由于经过愈伤组织分化阶段，体细胞变异的可能性较大，在快速繁殖中一般不采用这种方式。丛生芽增殖方式是指茎尖或腋芽在适宜的培养基上诱导，不断发生腋芽，再从芽的叶腋内长出小芽，腋芽不断形成又不断萌动，形成丛生苗，然后转入生根培养基，诱导生根成苗，扩大繁殖。由于在其增殖过程中，无需经过愈伤组织而可以再生，直接从芽到芽，是其无性系后代最能保持原品种特性的一种繁殖方式。这种增殖方式在数量、质量和经济等方面都优于其他传统的繁殖方式，因此，是林木快繁中运用最为广泛的一种繁殖方式。建立黄菠萝的组织培养体系，不仅可以迅速地获得大量优质的造林苗木，还可以为以后用作生物技术和基因工程方法对植物进行遗传改良。为此，笔者以带腋芽的茎段为外植体，以丛生芽增殖方式形成幼苗，采用正交设计方法研究影响黄菠萝离体再生的主要因素，建立高效离体再生的组培体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理 黄菠萝采自吉林省露水河林业局的天然近熟群体林，于2月份取成年树一年生的无病虫害枝条，带回实验室置于水中培养，取带腋芽的茎段为外植体，将其新萌发的幼嫩枝条采下后先在流水下反复冲洗0.5～1.0 h，再用饱和中性洗衣粉液洗涤枝条，流水彻底冲洗，滤纸吸干表面水分，转移到灭菌的超净工作台上，用70%～75%乙醇表面消毒15 s，将外植体在0.1% HgCl2溶液中消毒8 min后，接种在初代培养基上，每瓶接种1个外植体，每处理接种30瓶。

1.2 试验设计 采用正交设计，不同培养阶段各种因素水平见表1，每组试验重复3次。在正交试验中,初代培养统计外植体的诱导率，继代培养统计试管苗的高净增量，生根培养统计试管苗的生根数。

表1 不同培养阶段的因素水平

1.3 培养条件 所有培养基pH为 5.8，在121 ℃条件下高压灭菌15 min。培养温度为(22±2) ℃,光周期为14 h/d，光照强度为50～70 μmol/(m2·s)。

1.4 数据处理 对数据进行方差分析和多重比较，统计分析用SPSS完成。

2 结果与分析

2.1 初代最佳培养基的筛选 由表2可知，诱导黄菠萝的最佳初代培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.06 mg/L+蔗糖20 g/L，即最佳工艺组合是A2B3A3D2。方差分析结果表明，A、B、C、D 4个因素差异极显著。此外，4种基本培养基对茎段的诱导能力依次为MS>1/2MS>WPM>B5，它们之间差异均达到显著水平，且MS与其他3种达到极显著水平。从长势情况来看，MS培养基上茎段诱导的不定芽，叶片伸展，叶色鲜绿，节效果最好。

表2 初代培养正交试验结果

2.2 继代最佳培养基的筛选 方差分析结果表明，6-BA各水平间差异极显著，NAA各水平间差异显著，IBA各水平间差异不显著。各个因素的主次依次是A、B、C，表明在继代培养中细胞分裂素起的作用最大，2种生长素NAA比IBA的效果好。由于IBA各水平差异不显著，因此只对6-BA和NAA各水平间进行多重比较。由表3可知，2个因素均为第二个水平效果最好，由于IBA差异不显著，在2种生长素中只选择NAA，继代培养最佳激素组合为A2B2，即6-BA 1.0 mg/L，NAA 0.1 mg/L。

2.3 生根最佳培养基的筛选 方差分析结果表明，基本培养基各水平间差异极显著，6-BA各水平间差异不显著，NAA各水平间差异极显著，蔗糖各水平间差异极显著。各个因素的主次依次是A、C、D、B。由于6-BA差异不显著，因此只对其他3个因素的各水平间进行多重比较(表4)。由表4可知，生根培养的最佳组合为A1C2D3，即培养基为1/2MS，NAA浓度为0.4 mg/L，蔗糖浓度为30 g/L。

表3 继代培养正交试验结果

表4 生根培养正交试验结果

3 结论与讨论

培养基中含有外植体生长所需要的营养物质，是组织培养中外植体赖以生存和发展的基础。在初代培养中4种基本培养基对茎段诱导率的大小为MS>1/2MS>WPM>B5，它们之间差异均达到显著水平，且MS与其他3种达到极显著水平，从长势情况来看，MS培养基上茎段诱导的不定芽，叶片伸展，叶色鲜绿，节效果最好。而在生根培养阶段则需要低浓度的盐，4种基本培养基对根诱导率的大小为1/2MS>MS>WPM>B5。另外在组织培养的各个阶段，基本培养基都是最重要的因素，因此选择合适的培养基是组织培养成功与否的关键因素。

该研究使用的细胞分裂素是结构比较稳定的人工合成的6-BA。研究发现，在初代培养中， 6-BA的4个水平中分出了2个等级，尽管2、3水平上差异不显著，从方差分析的角度两者皆可选，但考虑3水平的平均值略高于2水平，所以选择了3水平的浓度，即6-BA选择1.5 mg/L。而在继代培养中对6-BA共设置了3个梯度，结果表明各水平间差异极显著，其中以1.0 mg/L最好。在生根培养中对6-BA共设计4个梯度，结果表明，4个水平下的6-BA差异不显著，因而在生根培养中6-BA的影响不大。综合来看，在初代培养中需要高浓度的细胞分裂素，在继代培养中6-BA的浓度有所降低，而在生根培养中6-BA的作用很小，甚至可以不加。

该研究所使用的生长素是NAA。研究发现，在初代培养中，4个因素中NAA的作用最小，但4个水平差异显著，3、4水平之间差异不显著，但只有3水平与其他2个水平差异极显著，而4水平与其他2个水平差异则不显著，因而选择3水平的0.06 mg/L作为NAA的最优浓度。在继代培养中NAA的作用明显优于IBA，IBA的作用不显著，与他人的结果不一致，可能是所设的浓度不理想所致。而NAA的浓度以0.1 mg/L为最佳。在生根培养中， NAA在4个因素中也比较重要，4个水平差异极显著，其中以0.4 mg/L诱导的根数最多。综合来看，在这3个培养阶段，NAA的浓度变化较大，且浓度逐渐升高。

糖是培养基中不可缺少的碳源，该试验选用的糖源是蔗糖，在不同培养阶段用量也不完全相同。在初代培养中，蔗糖含量对诱导率产生显著和极显著的影响，4个水平分出了2个等级，在2个较好的水平中，只有2水平下的结果与其他2个水平的结果差异极显著，因此2水平下的20 g/L蔗糖为最佳浓度。在生根培养中，4个蔗糖浓度水平下的生根数差异显著或极显著，比较而言3水平下的蔗糖浓度最好，即30 g/L。综合来看，在初代培养中蔗糖需求量不大，而在生根培养中则需要较高浓度的蔗糖。

正交设计是多因素分析的有力工具, 可以从许多因素中选出主要影响因素及最佳水平, 用较少的试验次数获得较多的信息[6]。正交设计可以精简试验次数、克服在培养基配方设计上的盲目性、提高工作效率和试验的可靠性[7]。近年来正交设计等统计方法应用于许多植物的离体培养[8-10],并取得良好的试验效果,但在黄菠萝组织培养中尚未见该方法的报道。该试验采用正交设计的方法,仅用较少的试验组合,通过统计学分析, 明确了黄菠萝初代、继代、生根培养各阶段的主要因素,同时优化筛选了最佳培养基,简化了研究方案,加快了研究进程。成功应用正交设计法的关键是参试因子和试验水平范围的正确选择。该试验中大多数参试因子产生的效应存在明显差异,筛选出来的培养基中各因子的水平基本在试验水平范围之内,能大体反映全部组合的试验效果,因此该试验对参试因子和试验水平范围的选择是较适宜的。该研究未考虑因子间的交互作用,需要在以后的研究和实践中进一步完善。

[1] 张泉,朱成仁.黄菠萝采种及育苗技术的研究[J].林业勘察设计,2005(3)：44-47.

[2] 龙作义,苑国，周敬伟.温室效应对塑料大棚黄菠萝育苗的影响[J].牡丹江师范学院学报,2005(2)：17-20.

[3] 于树成,张淑华，闫红霞，等.黑龙江省主要阔叶树种绿枝扦插效果初步分析[J].林业勘察设计,2003(1)：25-28.

[4] 李霞,阎秀峰,刘剑锋.氮素形态对黄檗幼苗三种生物碱含量的影响[J].生态学报,2005，25(9):2159-2164.

[5] 郭勇,石大兴,孙雁霞,等.黄檗的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯,2005，41(6):792.

[6] 李春喜,姜丽娜,邵云,等.生物统计学[M].北京：科学出版社，2005：177-183.

[7] 王建华,王义, 孙国伟, 等.人参组织培养的多因子正交试验研究[J].吉林农业大学学报,2006，28(6):648-651.

[8] 张菊红,谢妤,汪承刚,等.正交设计在欧洲菘蓝组织培养中的应用[J].湖北大学学报，2006，28(2)：183-186.

[9] 宋莉英,谭诤,高峰.苦瓜愈伤组织诱导的多因子正交试验研究[J]. 西南师范大学学报,2004，29(3):462-465.

[10] 李成慧,蔡斌,单丽丽,等.应用正交设计法探讨蝴蝶兰叶片类原球茎的诱导[J].扬州大学学报,2004，25(2):76-78.

Establishment for Regeneration System of Younger Stem ofPhellodendronamurenseRupr.invitro

WANG Xin-tian1, WANG Xin-yu2, LI Xiao-ping1et al

(1. Shuangliao City Forest Tree Seedlings Station, Siping, Jilin 136400; 2. Shuangliao City Zhengjiatun Forest Station, Siping, Jilin 136400)

[Objective] To optimizePhellodendronamurenseRupr.invitroculture regeneration system. [Method] By using axillary bud-bearing young stem ofPhellodendronamurenseas explants, the orthogonal experimental design was employed to study theinvitroculture and regeneration condition. [Result] The optimum primary medium was MS +1.5 mg/L 6-BA +0.06 mg/L NAA +20 g/L sucrose, the best growth regulatory substance combination of medium for subculture was MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA, and the best rooting medium was 1/2MS +0.4 mg/LNAA + 30 g/L sucrose. [Conclusion] Taking axillary bud-bearing young stem ofPhellodendronamurenseas explants, adopting orthogonal design to study itsinvitroculture and plants regeneration technique is feasible.

PhellodendronamurenseRupr.; Tissue culture; Regeneration system; Orthogonal design

王新天(1978- )，男，吉林双辽人，从事林木种苗生产和管理工作。

2015-04-07

S 604+.3

A

0517-6611(2015)17-310-03