HIV感染者口腔牙周致病菌检出情况分析

温龑++裴峻浩翔++段开文

摘要：目的 了解云南地区部分HIV感染患者口腔内牙周致病菌检出情况。方法 采用临床标本收集的方法，获得昆明市第三人民医院感染一科66例HIV感染者的唾液标本和龈沟液标本，通过DNA的提取和PCR检测，对标本中的6种牙周致病菌进行检测并运用统计学方法分析。结果 不同细菌在不同取材标本都有检出，且各种细菌的检出率差异很大，但同一细菌在不同样本中检出率差异却极小。另外，吸烟饮酒、不同CD4细胞计数和高效抗逆转录病毒治疗（highly active anti retrovial therapy，HAART）HAART对可疑牙周致病菌的检出均无明显影响。结论 应结合国内外的研究与报道，加强对HIV感染者口腔牙周致病菌的研究与检测，从而有针对性的治疗发生在HIV感染者口腔中的牙周疾病。

关键词：人类免疫缺陷病毒；牙周致病菌；龈沟液；唾液

Analysis for Detection of Oral Periodontal Pathogens in HIV Infected Patients

WEN Yan1，PEIJUN Hao-xiang1，DUAN Kai-wen2

（1.Yanan Hospital Affiliated to Kunming Medical University，Kunming 650051，Yunnan，China；

2.Department of Stomatology，Yanan Hospital of Kunming City，Kunming 650051，Yunnan，China）

Abstract：Objective To understand the detection of oral periodontal pathogens in part of HIV infected patients in Yunnan region.Methods The collection of clinic specimens were took to obtain the 66 cases of HIV infected patients，saliva and gingival crevicular fluid（GCF）samples which were come from the Third People，s of Kunming.The six kinds of periodontal pathogens were detected by extraction of DNA and PCR testing and analyzed by using statistical methods.Results The different bacteria have been detected in different specimens and the discrepancy of detection rate of these bacteria was significant.However，the difference of same bacterial in different samples was minimal.In addition，there was no manifest function on the detection rate of periodontal pathogens in aspects of smoking，drinking，different CD4 cell counts and highly active antiretroviral therapy（HAART）.Conclusion It is vital to strengthen the research and detection of oral periodontal pathogens in HIV infected patients through combine with domestic and international research and report to treat targeted periodontal disease that occurred in HIV infected patients.

Key words：Human immunodeficiency virus；Periodontal pathogens；Gingival crevicular fluid；Saliva

牙周疾病的发生一般被认为取决于宿主和存在的口腔定植微生物群之间的相互作用[1]。在HIV感染者龈沟液中频繁检测出较普遍存在的机会性微生物群，可能因为免疫抑制会促进非典型致病菌定居并增生，所以认识HIV感染者龈下区域不同的微生物特征很重要。研究表明HIV感染者牙周病变部位较于健康牙周组织微生物特点更复杂[2]，同时某些微生物的组合仅仅在HIV感染者中发现。本项研究的目的是应用多聚酶链反应技术检测6种常见的牙周可疑致病菌在HIV阳性患者口腔中的存在情况，并分析影响因素。

1资料与方法

1.1一般资料 纳入标准：2011年8月～9月前往昆明市第三人民医院感染一科就诊的HIV感染者共66例，其中未使用HAART 34例（A组），使用HAART 32例（B组）。健康对照组：2011年8月～9月前往昆明市延安医院进行健康体检的人群32例（O组），HIV阴性，年龄性别等基本与患者组匹配。排除标准：①3w内接受过口腔治疗；②患者自己不愿意配合。

1.2口腔样本的收集

1.2.1唾液标本 采集唾液前禁食1h并用蒸馏水漱口；采集时使用无菌脱脂棉从患者舌下、颊粘膜腮腺导管开口附近吸取唾液，将所获样本置于盛有1ml灭菌的硫乙醇酸盐溶液的EP管中，-70°C中保存。

1.2.2龈沟液标本 所选牙位为16、11、26、31、36、46，，所有受试者采样前均用1%H2O2溶液漱口，消毒棉球拭干，隔湿，将灭菌纸尖轻轻插入牙周袋或龈沟底30s，取样后的纸尖置于200？滋l TE缓冲液，-70℃冻存待用。

1.3两种标本DNA的抽提和纯度检测 采用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，DP302）进行唾液及龈沟液DNA的提取（具体步骤按生产厂家提供的说明书进行操作）。获得的DNA使用核酸定量仪检测纯度OD260/OD280比值，比值介于1.7～2.0，表示DNA纯度良好，能满足PCR检测要求。按下列公式计算浓度：

DNA浓度（μg/ml）=OD260×50×稀释倍数。

1.4口腔可疑牙周致病菌的PCR检测 第一步PCR反应：根据Siqueira等[3]报道的方法，设计16SrRNA细菌通用引物序列（见表1），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

第二步PCR反应：根据Siqueira等[3]报道的方法分别设计针对牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis），中间普氏菌（P.intermedia），齿垢密螺旋体（T.denticola），福塞尼杆菌（T.forsythensis），中间普氏菌（F.nucleatum），伴放线放线杆菌（A.actinomycetemcomitans）的特异引物（见表1），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

每次PCR扩增均设阳性对照和阴性对照。其中阳性对照为昆明医科大学附属口腔医院张明珠博士保存的6种国际参考标准菌株，阴性对照为去离子水，其目的是检测通用引物的通用性和特异引物的特异性。

1.5细菌检出判定 取6ul扩增产物，使用含0.5ug/ml溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统下观察并记录结果。临床样本中，若阳性对照获得相应条带而阴性对照未出现条带的情况，则记录该样本中此种微生物检出为阳性，否则为阴性。每种细菌每份标本做两次，若出现结果不一致，则重复进行。

1.6统计学分析 SPSS软件包进行统计学分析。对各组病原菌数量检出率进行统计，并比较其检出率与吸烟、饮酒、CD4计数等因素的关系；计数资料采用x2检验。

2结果

2.1不同取材口腔标本6种可疑牙周致病菌检出情况 采用巢式PCR技术对来自唾液和龈沟液标本进行6种细菌的检测表明，在不同类型标本均可检测不同的细菌。见图1～图7。下图显示了本研究所设计的通用引物和6种细菌特异引物从龈沟液提取的细菌DNA进行的巢式PCR检测情况。

图1部分龈沟液提取DNA的细菌16SrDNA扩增产物检测电泳图。

从右到左依次为：DNA Marker（DL100），阳性对照，阴性对照和8份样本提取DNA的扩增产物。

图2 部分龈沟液提取DNA牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）PCR检测电泳图

从右向左依次：DNA Marker（DL100），阳性对照，阴性对照和8份样本提取DNA的扩增产物。

图3 部分龈沟液样本提取DNA中间普氏菌（P.intermedia）检测电泳图

从右向左依次为：DNA Marker（DL100），阳性对照，阴性对照，和8份样本提取DNA的扩增产物。

图4 部分龈沟液样本提取DNA齿垢密螺旋体（T.denticola）检测电泳图

从右向左依次为：DNA Marker（DL100），阳性对照，阴性对照，和8份样本提取DNA的扩增产物。

图5 部分龈沟液样本提取DNA福塞尼杆菌（T.forsythensis）检测电泳图

从右向左依次为：DNA Marker（DL100），阳性对照，阴性对照，和8份样本提取DNA的扩增产物。

图6 部分龈沟液样本DNA具核梭杆菌（F.nucleatum）检测电泳图

从右向左依次为：DNA Marker（DL100），阳性对照，阴性对照，和8份样本提取DNA的扩增产物。

图7 部分龈沟液样本DNA伴放线放线杆菌（A.actinomycetemcomitans）检测电泳图

从右向左依次为：DNA Marker（DL100），阳性对照，阴性对照，和8份样本提取DNA的扩增产物。

2.2 6种可疑牙周致病菌在三组人群不同口腔标本的检出情况 对所有收集的唾液和龈沟液进行了6种细菌（P.gingivalis，P.intermedia，T.denticola，T.forsythensis，F.nucleatum，A.actinomycetemcomitans）的检测情况，见表2。从表中可以看出尽管不同细菌在不同取材标本都有检出，但各种细菌的检出率差异很大，检出率最高的是T.forsythensis（约98%），最低为A.actinomycetemcomitans（仅3.06%）。但同一细菌在不同样本中检出率差异极小，无统计学意义（P>0.05）。

2.3 6种细菌检出情况与其他一些因素之间的关系

2.3.1与吸烟饮酒之间的关系 三组人群按吸烟和饮酒程度进行了分级，分析吸烟和饮酒对6种细菌分布是否有影响，统计学分析显示，P.intermedia的检出率在轻、中、重度吸烟人群的样本检出率有统计学差异（P<0.01），其余5种细菌与抽烟程度无明显关系。而饮酒对6种细菌的检出率影响不大，无统计学意义（P>0.01）。

2.3.2不同CD4细胞计数与6种可疑牙周致病菌检出率之间的关系 将AB两组HIV感染者按CD4细胞计数水平分为≥500、201～499和≤200，分析6种细菌的检出率与CD4+T细胞计数之间关系，统计学分析表明无统计学差异。

2.3.3 HAART对6种可疑牙周致病菌检出的影响 本研究人群中有32例正在接受HAART治疗，将药物使用时间分为1～3月、3～6月和6月以上，分析了使用HAART时间长短与6种细菌检出的关系，三个时间段患者细菌检出率无统计学差异（P>0.05）。

3讨论

3.1 6种可疑牙周致病菌的检出情况 本研究采用细菌16sRNA为基础的PCR法，检测并比较了牙龈卟啉单胞菌（Pg）、中间普氏菌（Pi）、齿垢密螺旋体（Td）、福塞尼杆菌（Tf）、中间普氏菌（Fn）和伴放线放线杆菌（Aa）在HIV感染者和对照人群唾液和龈沟液中的检出情况，发现除伴放线放线杆菌仅在HIV阴性对照组中检出外，其它5种细菌在所有被检人群中均不同比例检出，且在不同部位所取样本的检验结果没有统计学差异。

关于可疑牙周致病菌在不同来源口腔标本的检出情况，国内外学者有诸多报道，但所得结论存在差别。Testa等[5]认为唾液和龈沟液样本在牙周致病菌的检出率中没有显著差异，但冯向辉等[6]发现唾液样本在伴放线放线杆菌的检测上精确性更高。

3.2 HIV感染者中6种牙周致病菌检查情况分析 在本组HIV感染者口腔标本中除伴放线放线杆菌外的5种细菌检出率与对照组没有统计学差异。Patel等[7]通过对20例HIV+/牙周炎患者的中间普氏菌和牙龈卟啉单胞菌等七种可疑牙周致病菌检测中发现，齿垢密螺旋体和牙龈卟啉单胞菌在HIV感染中较少发现。Gon？觭alves等[8]通过棋盘DNA杂交检测，在HIV+/牙周炎患者中发现一些典型的牙周致病菌检出率高于HIV+/牙周健康患者，且在两组中粪肠球菌（E.faecalis）检出率较高。各地报道差异很大，可能与研究人群、生活环境、全身健康等不同有关。

3.3 6种细菌检出情况与其他一些因素之间的关系 本研究发现中间普氏菌的检出率在不同程度的吸烟人群之间存在统计学差异，重度吸烟人群中其检出率明显下降，但没有发现饮酒与细菌检出率存在关系。

有研究显示，免疫抑制较严重的患者（CD4+T淋巴细胞计数低于200个/ml），粪肠球菌，具核梭杆菌的检出率明显增高，提示免疫抑制有利于一些细菌的定殖和过度繁殖。在本项研究中，在HIV感染者中6种细菌的检出率与不同的CD4+T细胞计数之间没有发现统计学差异。

国外有报道认为相比较于HIV阴性患有慢性牙周炎的人群，可疑牙周致病菌检出率更高，而一些非可疑牙周致病菌更常在接受HAART的HIV阳性人群中出现[9]，提示对于接受HAART的HIV感染者，牙周致病菌的种属有所变化。本研究没有发现接受HAART对6种观测细菌检出有影响，是否与观察时间短有关仍待探明。

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编辑/王敏