桑叶、桑枝、桑椹多糖的提取及含量测定

刘英　章碧忠　章可谓

摘要：目的 提取纯化桑叶、桑枝、桑椹多糖并测定其含量。方法 用水提醇沉法提取桑叶、桑枝、桑椹多糖。苯酚-硫酸紫外分光光度法测定桑叶、桑枝、桑椹多糖的含量。结果 果实桑椹中多糖含量最多，其次为桑叶，桑枝中多糖含量较少。结论 通过测定比较桑树不同药用部位的多糖含量，以充分开发利用桑树这一药用资源，同时为深入开发桑叶、桑枝、桑椹新资源提供有利的实验数据。

关键词：多糖；含量；提取

多糖在自然界中分布十分广泛，大多数高等植物、微生物、地衣、海藻和动物体内均有丰富的多糖。多糖作为初级代谢产物，不仅具有结构、支持与保护、能量来源和解毒作用等生物学功能，而且大多数具有明显的药理活性[1～3]。

桑叶、桑枝、桑椹为桑科Moraceae植物桑Morus alba L.的干燥叶，嫩枝和果实。桑叶始载于《神农本草经》，味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏风清热、平肝明目的功效；历代中医药书籍中记载桑叶能够治疗消渴症，现代药理研究表明桑叶有效成分之一桑叶多糖具有显著的降血糖作用。其所含化学成分种类较多，主要有多糖、黄酮类化合物，现代药理学研究表明桑枝具有抗真菌活性、抗炎、降血糖等作用。桑椹子为桑的果穗，又名桑果、桑实、桑枣等。质油滑，气微，味微酸而甜。我国许多地区都有分布，中医用于治疗肝肾阴亏、消渴、耳鸣、关节不利等症。

桑叶、桑枝、桑椹作为中医常用药有如此多的功效，目前有关桑树单个药用部位的多糖提取和含量测定略见报道。本实验采用水提醇沉法提取桑叶、桑枝、桑椹多糖。苯酚-硫酸比色法对其三者多糖的含量进行测定。通过测定比较桑树不同药用部位的多糖含量，以期充分开发利用桑树这一药用资源，同时为深入开发桑叶、桑枝、桑椹新资源提供有利的实验数据。

1材料、仪器及试剂

1.1原料 桑叶、桑枝、桑椹的干燥叶，嫩枝和果实。购于杭州市老百姓大药房。

1.2仪器 SPC22型紫外分光光度计，HH-S型电热恒温水浴锅，超导热风干燥箱，循环水式多用真空泵，分析天平，旋转蒸发仪。

1.3试剂 95%乙醇，蒸馏水，苯酚，浓硫酸及其他试剂均为分析纯，葡萄糖对照品，氯仿，正丁醇，活性碳。

2实验方法和结果

2.1多糖的提取纯化 分别称取桑叶、桑枝、桑椹各50.0 g，以6倍量蒸馏水先回流提取1h，趁热过滤，得滤液和残渣，将残渣再加6倍量蒸馏水提取45min。合并2次滤液，减压浓缩至约150mL。再加入活性炭脱色，搅拌均匀，静置过夜，多次过滤滤除活性炭，滤液再加入氯仿与正丁醇（4：1）混合液进行萃取脱蛋白，取上清液加95%乙醇醇析，使溶液含醇量达80%，静置沉降24h，醇析物抽干，得粗多糖。粗多糖沉淀用无水乙醇洗涤数次，60℃以下烘干，即得多糖无定形粉末。精密称重备用。

2.2多糖含量的测定

2.2.1苯酚试剂的配制 取苯酚200g，加铝片0.2g和NaHCO3 0.1g，蒸馏，收集182℃馏分，称取5g，加水100ml溶解混匀，即得。置棕色瓶内放冰箱中备用。

2.2.2最大吸收波长的选定 精密量取葡萄糖标准品贮备液1.0 ml置于15 ml具塞试管中，加入5%苯酚1ml，混匀，迅速加浓硫酸5ml，混匀，放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后置冷水浴中冷却5min。另以1.0ml蒸馏水同上平行操作为空白对照，于450～550nm波长范围内测定吸收度。确定最大吸收波长为490nm。

2.2.3标准曲线的制备 精密称取105℃烘至恒重的葡萄糖标准品10.3 mg水溶解并定容至100ml容量瓶中，则其浓度为103ug/ml。精密吸取葡萄糖标准贮备液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml置于15ml的具塞干燥试管中，加蒸馏水定容至1ml，再分别加入5%苯酚1ml，混匀，迅速加浓硫酸5ml，混匀，放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后置冷水浴中冷却5min。另以1.0ml蒸馏水同上平行操作为空白对照，于其最大吸收波长490nm处测其吸光度值。见表1，图1。

图1 标准曲线图

2.2.4样品溶液的制备 精确称取60℃干燥恒重的桑叶、桑枝、桑椹多糖各13.5mg，水溶解后定容到10ml容量瓶中，摇匀，做为多糖储备液。浓度为1.35 mg/ml。

2.2.5样品含量测定 精密吸取1.0ml样品溶液置于10ml的具塞干燥试管中，分别加入5%苯酚1ml，混匀，迅速加浓硫酸5ml，混匀，放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后置冷水浴中冷却5min。另以1.0ml蒸馏水同上平行操作为空白对照，于其最大吸收波长490nm处测其吸光度值。用回归方程计算各样品中桑叶多糖的含量为3.29%，桑枝多糖的含量为2.80%，桑椹多糖的含量为7.48%。见表2。

2.2.6精密度试验 精密吸取1.0ml样品溶液置于10ml的具塞干燥试管中，分别加入5%苯酚1ml，混匀，迅速加浓硫酸5ml，混匀，放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后置冷水浴中冷却5min。另以1.0ml蒸馏水同上平行操作为空白对照，于其最大吸收波长490nm处测其吸光度值，重复测定吸光度5次。见表3。

2.2.7稳定性试验 精密吸取同一样品溶液1.0ml，按样品测定方法操作，每隔15min测定一次吸光度。吸光度分别为：0.556，0.553，0.555，0.555，0.557，0.559，0.552，0.559。实验结果表明，样品溶液在2h内吸收度基本无变化。

2.2.8回收率实验 精密吸取样品液0.3 ml，分别加入标准液0.2ml，加入5%苯酚1ml，混匀，迅速加浓硫酸5ml，混匀，放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后置冷水浴中冷却5min。另以1.0ml蒸馏水同上平行操作为空白对照，于其最大吸收波长490nm处，测其吸光度值。见表4。

3讨论

3.1苯酚-硫酸法的原理为多糖在浓硫酸作用下先水解成单糖分子，并迅速脱水成糠醛衍生物，糠醛衍生物再与酚性物质如苯酚综合成有色化合物，以比色法在适当波长处测定多糖含量[4～6]。

3.2本文对桑叶，桑枝，桑椹的含糖量测定方法进行了摸索，最后确定了在490nm波长处进行比色测定的方法。结果表明，该方法简便、快速、准确，灵敏度高，专属性强，是进行该类成分测定的较理想方法。

3.3多糖沉淀中的主要杂质为色素、植物蛋白质。蛋白质的去除方法有盐析法、等电点沉淀法、加热变性法、有机溶剂变性萃取法、膜过滤法。加热变性法不能完全除去蛋白，等电点沉淀法要求操作精细，单一等电点不能满足除尽蛋白的目的，膜过滤法费时。加三氯乙酸去除蛋白质的原理：蛋白质在酸性条件下带正电荷，与三氯乙酸的酸根结合形成沉淀[7～9]。

3.4实验过程中需要注意加浓硫酸时，要充分摇匀，至颜色稳定（15min）后进行测定。实验证明本法简便，重现性好，测定结果在2h内稳定。

3.5本实验通过对桑叶，桑枝，桑椹的含糖量的测定，表明桑椹中多糖的含量最高，其次为桑叶，桑枝较少。

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编辑/王海静