急性早幼粒细胞白血病患者外周血单个核细胞PML-RARα融合基因检测和意义

西安交通大学附属西安市中心医院血研所(西安 710003)

郭晓波 蔺 京 杨 乐 胡志萍△ 姚 静▲ 郑全庆*

急性早幼粒细胞白血病患者外周血单个核细胞PML-RARα融合基因检测和意义

西安交通大学附属西安市中心医院血研所(西安 710003)

郭晓波 蔺 京 杨 乐 胡志萍△姚 静▲郑全庆*

目的：探讨PML-RARα融合基因与急性早幼粒细胞白血病(APL)的相关性。方法： 利用实时荧光定量PCR检测50例APL患者血液标本(骨髓/外周血)中PML-RARα融合基因含量，30例健康体检者作为正常对照组。结果： 50例APL患者血液标本中PML-RARα融合基因含量阳性47例(94%；47/50)，阴性3例(6%；3/50)。正常对照组均阴性，APL组阳性率明显高于正常对照组，差异具有统计学意义。30例治疗后血液学完全缓解的患者治疗前后进行PML-RARα融合基因的检测，其中25例患者(25/30；83.3%)的PML-RARα融合基因拷贝数较治疗前有明显降低，差异具有统计学意义。另16.7%(5/30)患者复发时PML-RARα融合基因拷贝数明显增高，与初诊时无明显差异。结论： 检测PML-RARα融合基因对APL患者在诊断、疗效观察和预后判断等方面都具有重要意义。

急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia, APL)为急性髓细胞白血病(Acute myelocytic leukemia, AML)的一种亚型，约占AML的7%～27%[1]。患者骨髓中出现大量异常早幼粒细胞，其中95%以上伴有特异性染色体异位t(15;17)(q22;q21)/ PML-RARα融合基因阳性[2]。APL患者的临床特点是出血倾向严重，常易并发弥散性血管内凝血(Diffuse intravascular clotting ,DIC)，导致早期死亡。但随着全反式维甲酸(All-trans-retinoicacid, ATRA)、砷剂及联合化疗的广泛应用，APL患者的临床缓解率及5年生存率居急性髓细胞白血病首位[3]。如何更好的对APL患者进行早期诊断，疗效观察及预后判断成为影响患者获益的重要因素。PML-RARα作为一种转录抑制物通过抑制多种骨髓分化相关基因的表达产生效应[4]。同时PML-RARα也有针对AP-1、GATA2等转录因子共激活物的功能。有研究显示部分白血病含有染色体交互异位，产生的融合基因与白血病的发生，发展密切相关。本文对APL患者进行PML-RARα融合基因检测，分析其与APL的相关性。

资料和方法

1 一般资料 50例APL病例均为我院2012年8月～2014年6月住院病人，均经骨髓涂片和活检诊断证实，其中男28例,女22例，年龄14～60岁，中位年龄44岁。正常对照组30例,男18例，女12例,均为我院健康体检者，年龄20～65岁,中位年龄39岁,均排除肝、肾，心脑血管疾病和血液学的异常。所有临床资料及标本均在取得患者知情同意后采集。根据1987年全国白血病化疗讨论会制定的标准，APL患者给予全反式维甲酸(ATRA)、砷剂及DA方案治疗。

2 仪器与试剂 美国伯乐CFX96荧光定量PCR仪，RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒天根生化科技有限公司，融合基因试剂盒(PML-RARα)购自上海之江生物科技股份有限公司。

3 检测方法 抽取患者骨髓或者静脉血5.0ml加入装有EDTAK2作为抗凝剂的试管中，混匀，将标本通过使用红细胞裂解液除去血液(骨髓)中的红细胞，获得白细胞；用RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒从上步获得的白细胞沉淀中提取RNA。将核酸荧光PCR混合液分别与等人份的RT-PCR酶混合，震荡混匀数秒，3000rpm离心5sec。将上述配制好的体系置于PCR管中，然后将提取好的RNA、DEPC-H2O、对照品、标准品分别加入对应管内。反应管置于荧光PCR仪上，设置循环参数：45℃×20min→95℃×5min，再按95℃×15sec→58℃×30sec→72℃×45sec,循环45次；单点荧光检测在58℃。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。整个实验操作均严格按照操作规范进行，同时做内参，阳性和阴性对照，均在控。

4 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件，数据比较采用χ2检验,检验水准α=0.05。

结 果

50例APL患者PML-RARα融合基因阳性47例，占94%(47/50)，阴性3例，占6%(3/50)。正常对照组均为阴性。APL初诊组阳性率明显高于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中42例经全反式维甲酸(ATRA)、砷剂、DA方案化疗治疗后血液学完全缓解(CR)。30例血液学完全缓解患者治疗前后进行PML-RARα融合基因的检测，其中25例(83.3%)PML-RARα融合基因拷贝数明显下降，平均下降俩个数量级，治疗前后比较差异具有统计学意义(P<0.01)。观察其中5例患者复发时PML-RARα融合基因拷贝数明显增高，与初诊时拷贝数无明显差异(P>0.05)。

讨 论

急性早幼粒细胞白血病(APL)是一种以早幼粒细胞分化受阻为主要特征的急性髓系白血病，此病起源于髓系早幼粒细胞，由于其肿瘤细胞中存在较多的促凝颗粒， 临床上多伴发弥散性微血管凝血， 易导致 APL 患者的早期死亡[5]。寻找能够有效对APL患者进行早期诊断，疗效观察及预后判断而且临床应用简单快捷的检验指标对临床诊疗具有重要意义。研究发现95%以上的APL伴有特异性染色体异位t(15;17)(q22;q21)/ PML-RARα融合基因阳性[2]。本研究中通过RT-PCR对50例APL患者进行PML-RARα融合基因检测，阳性率达94%，敏感度高。我们进一步对经治疗后血液学完全缓解的患者进行治疗前后的对比，结果显示绝大多数患者PML-RARα融合基因拷贝数出现明显下降，进一步观察，出现复发后PML-RARα融合基因拷贝数再次增高，说明该基因拷贝数与治疗疗效明确相关。可以预测APL患者的治疗反应，定量白血病细胞的残余数量和预测复发。有研究显示该指标比细胞遗传学检查早数月。PML-RARa 阳性强烈预示着复发的可能，而其持续阴性则预示病人有更长的无病生存期。

本研究提示对APL患者进行PML-RARα融合基因检测有重要的临床价值，可为患者的诊断，疗效观察和预后判断提供有效的帮助。临床全面复发时拷贝数水平相当或超过初诊时，提示选择的分子标志在疾病复发时仍能检测到，进一步证实了检测结果的可靠性，并为临床更加准确地预测早期复发提供依据。

[1] Mi J. Current treatment strategy of acute promyelocytic leukemia. FrontMed[J],2011,5(4) :341-347.

[2] de Thé H,Le Bras M, Lallemand-Breitenbach V. The cell biology of disease:Acute promyelocytic leukemia, arsenic, and PML bodies[J]. J Cell Biol, 2012,198(1): 11-21.

[3] Sanz MA. Lo-Coco F, Modern approaches to treating acute promyelocytic leukemia[J]. J Clin Oncol,2011,29(5): 495-503.

[4] Ablain J, de The H .Revisiting the differentiation paradigm in acute promyelocytic leukemia[J]. Blood 2011,117: 5795 - 5802.

[5] Matsushita T,Watanabe J, Honda G,etalThrombomodulin alfa treatment in patients with acute promyelocytic leukemia and disseminated intravascular coagulation: A retrospective analysis of an open-label, multicenter, post-marketing surveillance study cohort [J]. Thromb Res ,2014,33(5):772-781.

(收稿：2015-01-20)

白血病，早幼粒细胞，急性/免疫学 单核细胞 @PML-RARα基因 基因融合

R392.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.011

△西安交通大学口腔医院

▲西安交通大学医学院第二附属医院

*通讯作者：西安交通大学公共卫生学院