仿刺参骨片的种类和形态学研究

张莉恒, 丁 君, 韩昭衡, 常亚青, 宋 坚, 田 莹, 白雪秋, 丁文君

(大连海洋大学 农业部北方海水增养殖重点实验室, 辽宁 大连 116023)

海参隶属于棘皮动物门(Echinodermate), 海参纲(Holothuroidea)。全世界海参约有 160个属, 近1400种, 中国约有海参140种[1]。目前海参相关研究多为分子生物学[2-6]和遗传育种[7]方面, 海参骨片形态学研究较少。海参体内真皮层具骨片, 海参的骨片通常被认为是胚胎期骨骼的存留, 其主要成分是碳酸钙。不同种海参的骨片类型不同, 海参骨片是进行海参分类的重要依据[8]。国内外已有学者对海参骨片进行了研究, 廖玉麟[9]对中国134种海参进行了形态学分类; Massin等[10]对糙海参(Holothuria scabra)幼参的骨片发育进行了研究; Richard Rasolofonirina和Michel Jangoux[11]对糙海参(H.scabra)幼虫和稚参的骨片进行了研究, 确定了糙海参(H.scabra)不同类型骨片出现的时期; 另外, 李赟等[12]比较了国内外15种海参体壁的骨片类型; 文菁等[13]利用扫描电镜对中国 6种热带海参体壁骨片的组成和类型进行了研究, 丰富了海参骨片形态学的研究信息。

目前, 国内外关于海参体壁骨片的研究有报道,但仿刺参各组织的骨片类型及骨片在不同组织中的分布, 各类型骨片的相对比例与仿刺参年龄相关关系的研究尚未见报道。本研究以大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室培育的 1~3龄仿刺参(Apostichopus japonicus)为研究对象, 采用原位压片法研究仿刺参各组织的骨片类型及应用 SPSS软件统计各类型骨片相对比例, 为仿刺参的基础生物学研究提供资料, 为其年龄鉴别提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用材料为大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室培育的1~3龄仿刺参, 1龄仿刺参平均体长为54.7 mm±1.5mm; 2龄仿刺参平均体长为81.7 mm±2.0mm; 3龄仿刺参平均体长为 102.3±1.8mm。按年龄将仿刺参分为3组, 每组取5头, 分别取棘、纵肌、触手、管足、呼吸树、体壁和肠 7种组织进行分析。其中每头仿刺参取棘(6个)、纵肌(5cm)、触手(4~8根)、管足(4~8根)、呼吸树(6 小枝)、体壁(背部, 1cm×1cm×1cm)、肠(上升肠、下降肠各4段, 每段1cm)7种组织。

1.2 实验方法

采用 NaClO法和原位压片法两种方法制备仿刺参各组织标本, 比较样本制备结果; 采用原位压片法研究不同年龄仿刺参各组织骨片类型; 采用扫描电子显微镜法观察仿刺参各组织骨片的显微结构。

1.2.1 NaClO法

将仿刺参各组织用无菌海水冲洗干净, 并用滤纸吸干水分, 将所取组织置于 1.5mL的离心管, 滴加0.5~1 mL30%次氯酸钠溶液, 消化20~60 s, 可见离心管底部出现白色颗粒, 待白色颗粒完全沉淀后,用吸管吸取上层溶液, 蒸馏水重复漂洗3次。用吸管将骨片转移到载玻片上, 置于自然条件下干燥, 将载玻片置于显微镜(Nikon ECLip5E 50i)下观察, 并拍照。

1.2.2 原位压片法

将所取仿刺参各组织用无菌海水冲洗干净, 并用滤纸吸干水分, 将组织展开平铺于玻片上, 并吸干组织周围水分, 在组织样上加盖玻片, 轻轻敲击盖玻片, 使样品充分分散(避免出现气泡); 在显微镜(Nikon ECLip5E 50i)下观察, 并拍照。

1.2.3 扫描电子显微镜法

将0.1mol/L PBS缓冲液滴入由NaClO法获得的骨片样品离心管, 静止 5min左右, 待骨片沉淀后更换清洗液, 重复3次, 清洗NaClO等残留物; 将含有骨片的溶液滴到载玻片上, 使用不同梯度叔丁醇(50%、70%、80%、90%、95%、100%)脱水, 每 3min更换一次梯度; 吸干叔丁醇, 并将骨片放到电镜(JEOL JEM-1200EX)观察台上, 镀膜并进行观察,拍照。

1.3 数据分析

利用Excel和SPSS16.0软件对获得的数据进行统计分析, 采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检测, 显著水平设置为P<0.05。

2 实验结果

2.1 NaClO法和原位压片法制备仿刺参各组织骨片标本结果比较

采用NaClO法和原位压片法均能获得仿刺参各组织骨片标本(图1)。经过NaClO法获得的骨片已与组织分离, 由于不附带其他组织, 标本较干净, 但骨片结构已损坏, 且不能观察到骨片在组织中的分布。原位压片法制样简单, 骨片结构较完整, 且能观察到骨片在组织中的分布状态, 适于仿刺参各组织骨片的观察统计。因此, 在以下研究不同年龄仿刺参各组织骨片类型分析采用原位压片法, 而电镜扫描法前期处理采用NaClO法。

图1 仿刺参触手骨片标本Fig.1 The production of Apostichopus japonicus tentacle bone chips

2.2 仿刺参不同组织骨片类型分析

利用原位压片法对不同年龄仿刺参各组织骨片类型及骨片在不同组织中的分布进行分析, 仿刺参各组织中存在桌形体、扣形体、杆状体、花纹状体、复合盘状骨片和长孔状体 6种主要骨片类型。仿刺参各组织中的骨片类型存在差异(图2)。仿刺参体壁中存在的骨片类型为扣形体、桌形体和杆状体; 管足中存在的骨片类型为扣形体、桌形体和复合盘状骨片, 其中复合盘状骨片是管足特有的骨片类型; 棘中存在的骨片类型为扣形体、桌形体和杆状体; 触手中存在的骨片类型为扣形体、桌形体和杆状体; 肠和呼吸树中存在的骨片类型为花纹状体; 纵肌中不存在任何类型骨片; 另外, 在3龄仿刺参的肠及呼吸树中发现了C形体。

图2 仿刺参不同组织骨片的显微观察图Fig.2 Ossicles of different tissues of Apostichopus japonicus observed under microscope

利用Excel和SPSS16.0软件对不同年龄仿刺参各组织中存在的不同类型骨片进行记数及统计分析,结果见表1。

由表1可知, 仿刺参不同组织中桌形体骨片比例是不一致的, 在1龄仿刺参中, 体壁和触手中桌形体相对比例较高, 分别达到 12.15%±2.99%和11.55%±2.69%; 2龄和3龄仿刺参中, 管足和棘中桌形体相对比例较高, 2龄仿刺参管足和棘中桌形体比例分别为21.83%±5.64%和24.16%±0.93%, 3龄仿刺参管足和棘中桌形体比例分别为 8.89%±4.84%和11.36%±3.22%。不同年龄仿刺参相同组织中桌形体骨片的相对比例也存在差异, 2龄仿刺参管足中桌形体骨片相对比例为 21.83%±5.64%, 显著高于1龄仿刺参管足中桌形体相对比例(P<0.05); 2龄仿刺参棘和触手中桌形体骨片相对比例分别为24.16%±0.93%和20.76%±2.34%, 显著高于1龄和3龄仿刺参棘和触手中桌形体相对比例(P<0.05)。

由表1可知, 仿刺参不同组织中扣形体骨片相对比例不一致, 1-3龄仿刺参棘和体壁中扣形体相对比例较高, 触手中扣形体比例最低, 触手中扣形体比例分别为 36.58%±6.13% 、49.61%±2.46%、7.68%±2.89%。不同年龄仿刺参相同组织中扣形体骨片相对比例具有显著差异性, 2龄仿刺参棘中扣形体相对比例为65.45%±1.79%, 显著低于1龄和3龄仿刺参棘中扣形体(P<0.05); 3龄仿刺参触手中扣形体相对比例为7.68%±2.89%, 显著低于1龄和2龄仿刺参触手中扣形体(P<0.05)。

表1 不同年龄仿刺参不同组织各类型骨片分析Tab.1 The types of ossicles of different tissues in Apostichopus japonicus Selenka with different ages

2.3 仿刺参各组织骨片显微结构观察

在扫描电子显微镜下观察仿刺参骨片的显微结构, 发现不同组织中相同类型骨片的形态结构一致,不存在组织间特异性。桌形体骨片(图3A)由底盘和立柱组成, 底盘近似为圆形, 具有穿孔, 底盘边缘具突起, 中央有1塔部, 由4个立柱和1个横梁构成。扣形体(图3B)近似于圆形或椭圆形, 具有大小不等的圆孔, 通常中央部位圆孔较大, 边缘部位圆孔较小, 与桌形体的底盘类似, 本次研究在电镜下还发现了部分扣形体一面具有 4个突起痕迹(箭头所示),推测可能与桌形体的 4个立柱存在某种关系。杆状体主要存在于体壁、棘和触手等外部组织中, 杆状体(图3C)是最简单的骨片, 不分枝, 表面具有瘤。长孔状体(图3D)为长椭圆形, 两侧分布大小不等、近似椭圆形的细孔。花纹状体(图3E)为呼吸树和肠中所特有的骨片, 呈“8”字型, 边缘有不规则排列的卷曲状分枝, 每个分枝孔并不光滑, 表面具有小突起。复合盘状骨片是仿刺参管足所特有的骨片, 其形状近似圆形, 为多层网状, 由许多小骨片组成, 具有突起,附着扣形体和桌形体(图3F)。

图3 不同类型骨片的扫描电镜图Fig.3 Scanning electron microscopy images of different types of ossicles

3 讨论

3.1 实验方法

国内外学者对于海参骨片形态学研究通常采用NaClO法、NaOH法、蛋白酶法, 本研究采用NaClO法和原位压片法。通过比较NaClO法和原位压片法两种实验方法发现, 原位压片法具有制样简单, 骨片不易碎, 结构较完整, 以及能显示出骨片在组织中的分布状态等优点, 同时具有制作的骨片标本观察不够清晰的缺点, 原位压片法是一种适于观察骨片完整结构的方法, 推荐使用原位压片法观察骨片。NaClO法能观察到较干净的骨片, 但骨片损坏、结构不完整。所以本研究在对不同年龄仿刺参各组织骨片类型进行分析时采取原位压片法, 使能观察到较完整的骨片, 而电镜扫描法前期处理采用NaClO法。

3.2 仿刺参各组织中骨片类型分析

研究仿刺参不同组织的骨片类型发现, 不同组织间骨片类型具有差异性, 例如, 管足中存在独特的复合盘状骨片; 肠和呼吸树中存在花纹状体; 纵肌中不含有任何类型骨片; 另外, 在3龄仿刺参肠和呼吸树中发现了 C形体, 而通常认为仿刺参中不存在 C形体骨片[9]。陈建伟等[14]同时比较了海参背脊部、腹部、触手、口部和肛门部骨片的特征, 结果表明, 海参不同部位骨片类型存在明显不同, 例如, 背部多为扣形体, 触手多为杆状体骨片, 与本研究结果有相同之处。进一步比较不同组织中相同类型骨片发现, 仿刺参不同组织中相同类型骨片的形态结构一致, 无组织特异性, 如管足和体壁中的桌形体骨片形态结构一致。Delboni[15]研究了Synaptula hydriformis海参的骨片生长, 并记录了锚形体等骨片类型的生长变化过程。本研究发现扣形体一面存在4个突起痕迹, 推测为桌形体退化形成, 是否能作为仿刺参骨片间类型转化依据还有待进一步探索。本研究为仿刺参的基础生物学研究提供资料。

3.3 不同年龄仿刺参不同组织各骨片相对比例分析

国外学者 Rowe[16]认为海参骨片类型的进化过程是由简单到复杂, 例如由杆状体和花纹状体进化到桌形体和扣形体, Levin的结论与之相反, 认为骨片进化过程是由复杂到简单。本研究发现随着仿刺参年龄的增长发现, 不同年龄仿刺参不同组织各类型骨片的比例是动态变化的, 例如, 桌形体骨片的“桌腿”消失; 1龄仿刺参体壁、触手中桌形体的含量高于管足和棘, 但到了2龄、3龄, 管足和棘中的桌形体的含量高于体壁和触手。这种变化造成不同年龄仿刺参不同组织中各类型骨片的相对比例存在差异。对于桌形体骨片, 1龄、2龄、3龄仿刺参触手间桌形体骨片相对比例存在显著差异性(P<0.05)。对于扣形体骨片, 2龄仿刺参棘中扣形体骨片相对比例显著低于 1龄和3龄仿刺参棘中扣形体相对比例(P<0.05)。通过仿刺参各组织不同类型骨片相对比例综合分析, 可为仿刺参的年龄判断提供参考。

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