CRISPR/Cas9技术在HepG2基因组中进行定点基因突变的探索

肖利佳，龙寿斌，罗历，沈化清，郝建华

(广东医学院附属南山医院检验科，广东深圳518052)

CRISPR/Cas9技术在HepG2基因组中进行定点基因突变的探索

肖利佳，龙寿斌，罗历，沈化清，郝建华

(广东医学院附属南山医院检验科，广东深圳518052)

目的探索利用CRISPR/Cas9技术在细胞株HepG2基因组中进行定点突变。方法设计并构建靶向核受体LRH-1和ERRα基因组序列的gRNA质粒。将构建好的gRNA质粒和hCas9质粒转染HepG2细胞后，PCR扩增HepG2基因组中LRH-1和ERRα基因的突变位点，并用SURVEYOR法检测突变情况。结果靶向核受体LRH-1和ERRα基因组序列的gRNA质粒构建成功。HepG2细胞经gRNA-LRH-1/gRNA-ERRα和hCas9转染后，针对LRH-1和ERRα的突变位点基因组序列的PCR产物经SURVEYOR法检测结果显示出现两条与预计大小相符的电泳条带。结论在HepG2细胞中成功利用CRISPR/Cas9技术介导的基因组编辑对LRH-1和ERRα特定基因组序列产生突变，为构建其细胞株敲除模型奠定了基础。

CRISPR；HepG2；基因组编辑；定点突变

由依赖于规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和Cas蛋白(CRISPR associated proteins)构成的CRISPR/Cas9系统是一类广泛存在于细菌和古细菌体内的免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA[1-3]。此系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)与tracrRNA(Trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/ crRNA复合物，此复合物能引导核酸内切酶Cas9在与crRNA碱基配对的靶序列剪切双链DNA。随后研究证实通过异位表达CRISPR/Cas9系统中的关键因子，同样可以在哺乳动物基因组诱发双链DNA断裂[4]。哺乳动物基因组中的双链DNA断裂主要是通过随机插入或删除的非同源重组的末端修饰(Non-homologous end joining，NHEJ)进行修复，因此可以通过此种方法在哺乳动物基因组中诱发定点突变。以往研究证实将crRNA和tracrRNA融合在同一个质粒上表达，同样可以引导Cas9特异性地切断靶DNA序列[5-6]。……