一株吡啶降解菌的筛选及其降解性能

陈 佩，颜家保，余永登

（1. 武汉科技大学 化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081；2. 武汉科技大学 教务处，湖北 武汉 430081）

一株吡啶降解菌的筛选及其降解性能

陈 佩1，颜家保2，余永登1

（1. 武汉科技大学 化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081；2. 武汉科技大学 教务处，湖北 武汉 430081）

以吡啶为唯一碳源，从焦化厂活性污泥中分离得到一株对吡啶具有高效降解能力的菌株B1，对其进行了菌种鉴定。通过单因素实验研究了菌株B1适宜的降解条件，对反应过程进行了动力学拟合，并考察了菌株B1对焦化废水中吡啶的降解效果。实验结果表明：菌株B1为革兰氏阴性菌，属于不动杆菌属（Acinetobactersp.）；菌株B1适宜的降解条件为降解温度30 ℃、初始pH 为7、摇床转速150 r/min；菌株B1对吡啶的降解过程符合零级反应动力学模型，当初始吡啶质量浓度为300 mg/L时，降解速率常数最高达到21.103 mg/（L·h）；用菌株B1对初始吡啶质量浓度为430 mg/L的实际焦化废水处理74 h后，吡啶降解率可达74.26%。

吡啶降解菌；菌种筛选；活性污泥；焦化废水；动力学

吡啶是一种典型的含氮杂环化合物，普遍存在于焦化、炼油、皮革和制药等行业的废水中［1］。吡啶对环境的危害较大，并能影响人体的肝、肾功能，麻痹中枢神经系统，甚至致癌［2］。由于吡啶的化学性质稳定，因此废水中的吡啶很难用传统的生物处理法去除［3］。采用生物强化技术，向生物处理系统中投加吡啶的高效降解菌，可提高吡啶的去除效果［4-5］。国内外分离出的能降解氮杂环化合物的微生物主要有：芽孢杆菌属（Bacillussp.）［6］、假单胞菌属（Pseudomonassp.）［7］和副球菌属（Paracoccussp.）［8］等。

本工作从焦化厂活性污泥中筛选得到一株以吡啶为唯一碳源的高效降解菌，对该菌进行了生理生化和16S rDNA鉴定，并就其降解特性和降解动力学进行了研究，为吡啶的生物强化处理提供了基本理论依据。

1 实验方法

1.1 材料和仪器

实验所用化学试剂均为分析纯。

活性污泥：取自武汉平煤武钢联合焦化有限责任公司污水厂曝气池。

焦化废水：取自武钢联合焦化有限责任公司污水厂曝气池进水，COD约为4 800 mg/L，ρ（NH3-N）约为200 mg/L，pH为6.5。

LB培养基：NaCl 10.0 g，蛋白胨 10.0 g，酵母提取物5. 0 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH约为7.2。

吡啶-无机盐培养基：K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，NH4Cl 0.5 g， MgSO4·7H2O 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.02 g， CaCl20.02 g， NaCl 0.1 g，微量元素储备液2 mL，蒸馏水定容至1 000 mL，pH约为7。120 ℃、0.10～0.15 MPa高压灭菌后，加入一定量的吡啶作为唯一碳源。

平板培养基：在吡啶-无机盐培养基中加入质量分数为1.5%～2.0%的琼脂。

Mastercycle Gradient型PCR扩增仪：德国Eppendorf公司；1100 C型高效液相色谱仪：美国Agilent公司。

1.2 菌株筛选

取2 mL活性污泥加入到已灭菌的100 mL LB培养基中，置于30 ℃、150 r/min恒温摇床富集培养24 h。取2 mL富集后的菌液依次转接到100 mL 质量浓度为100，200，300，400，500，600 mg/L的吡啶-无机盐培养基中，于30 ℃、150 r/min恒温摇床培养10～12 h，以此来驯化吡啶降解菌。采用稀释平板涂布法分离单菌落，再用划线法分离纯化2～3次。最后，将纯化得到的菌株分别用600 mg/L的吡啶-无机盐培养基培养，检测各菌株对底物的降解能力，将降解能力最好的一株单菌选定为优势菌。

1.3 菌种鉴定

将优势菌的培养液稀释涂布到平板培养基上，于37 ℃下培养24 h，观察菌落形貌。按照文献［9］报道的方法进行生理生化实验。提取该菌株的DNA［10］，进行16S rDNA PCR扩增，委托武汉擎科创新生物科技有限公司进行测序。

1.4 优势菌的降解特性

将优势菌的新鲜菌液按2%（φ）的接种量接入100 mL质量浓度为300 mg/L的吡啶-无机盐培养基中，考察降解温度、初始pH、摇床转速等条件对吡啶降解率的影响。

1.5 优势菌的降解动力学

将优势菌的新鲜菌液按3%（φ）的接种量接入不同浓度的吡啶-无机盐培养基中，在最优条件下进行降解反应，间隔一定时间取样，测定培养液中剩余吡啶的质量浓度，并用反应动力学模型对优势菌的降解数据进行拟合。

1.6 实际废水中吡啶的降解

将焦化废水用蒸馏水稀释至COD约为800 mg/L，添加适量吡啶，使初始吡啶质量浓度为430 mg/L。分别按以下4种方式加入优势菌：1）不加菌液和活性污泥（空白）；2）3 mL菌液；3）3 mL活性污泥；4）3 mL菌液+3 mL活性污泥。在30℃、150 r/min的条件下，考察优势菌对焦化废水中吡啶的降解效果，以及菌种与污泥之间的相互作用。

1.7 分析方法

采用高效液相色谱法测定吡啶含量［11］。

2 结果与讨论

2.1 优势菌的筛选与鉴定

经过分离纯化，得到7株能降解吡啶的菌株，选取其中降解效果最好的一株B1作为优势菌，进行菌种鉴定。实验结果表明，菌株B1为革兰氏阴性菌，在LB培养基上菌落呈圆形，微凸，表面湿润光滑。对菌株B1进行16S rDNA测序，将测得的基因序列用Blast软件进行比对，数据分析结果表明，序列相关性与菌株B1达到99%甚至更高的菌种都是不动杆菌属（Acinetobactersp.），因此可以推断菌株B1在分子生物学上可以归类于不动杆菌属（Acinetobactersp.）。菌株B1的系统发育树见图1。

2.2 降解条件

2.2.1 降解温度的影响

在初始pH 为7、摇床转速160 r/min的条件下，降解温度对剩余吡啶质量浓度的影响见图2。由图2可见：在降解反应开始的3 h内，不同温度下，吡啶的降解程度差别不大，可能原因是细菌在这段时间内处于调整期，外界环境温度的影响可以忽略不计；6 h后，菌株B1对吡啶的降解能力在不同温度下存在明显差异，25～30 ℃时，温度越高，菌株B1对吡啶的降解效果越好；30～40 ℃时降解效果显著下降，可能是由于温度过高使得微生物体内酶的活性受到抑制，阻碍了微生物的正常代谢；因此30℃是B1的最适宜降解温度。

图1 菌株B1的系统发育树

图2 降解温度对剩余吡啶质量浓度的影响

图3 初始pH对剩余吡啶质量浓度的影响

2.2.2 初始pH的影响

pH太小或太大都能使微生物酶的活性丧失，影响细菌的正常生长代谢。在降解温度30 ℃、摇床转速160 r/min的条件下，初始pH对剩余吡啶质量浓度的影响见图3。由图3可见：初始pH为3和5时，吡啶的降解程度很低，说明菌株B1在酸性环境下生长受到了抑制；当初始pH为7～10时，反应18 h后，吡啶几乎被完全降解，说明菌株B1对pH的适应力较强，在中性或碱性环境下都能存活，可能是因为吡啶在降解过程中，发生氧化反应产生了戊二酸，酸性物质中和了碱性条件下的碱性物质。因此，菌株B1降解的最适初始pH为7。

2.2.3 摇床转速的影响

在降解温度30 ℃、初始pH为7的条件下，摇床转速对剩余吡啶质量浓度的影响见图4。

图4 摇床转速对剩余吡啶质量浓度的影响

由图4可见：随降解时间的延长，不同摇床转速时吡啶的降解效果慢慢显露出差异；转速过高或过低都会有碍吡啶的降解效果，转速过低时，培养基中的溶解氧浓度降低，细菌的生长代谢放缓；摇床转速为150 r/min和200 r/min时，吡啶的降解曲线基本重合，且吡啶质量浓度较低，这是因为摇床转速为150 r/min时，培养基中的溶解氧基本达到饱和，再进一步增加摇床转速也不能提高溶解氧。综合考虑，选取150 r/min为最适摇床转速。

2.3 菌株B1的降解动力学

不同初始质量浓度下吡啶的降解效果见图5。由图5可见，剩余吡啶质量浓度（ρ）与降解时间（t）的关系曲线近似为直线，说明菌株B1对吡啶的降解符合零级反应动力学方程。拟合得到的菌株B1降解吡啶的零级动力学方程见表1。由表1可见：各初始吡啶质量浓度下得到的直线方程的相关系数均大于0.9；初始吡啶质量浓度为50～300 mg/L时，随初始吡啶质量浓度的增加，菌株B1对吡啶的降解速率常数逐步增大；当初始吡啶质量浓度为300 mg/L时，降解速率常数最大，达21.103 mg/（L·h）；当初始吡啶质量浓度大于400 mg/L时，随初始吡啶质量浓度的增加，降解速率常数反而降低，这可能是因为底物浓度过高时，底物毒性超出了菌体承受能力范围，阻碍了菌体对底物的降解。

图5 不同初始质量浓度下吡啶的降解效果

表1 菌株B1降解吡啶的零级动力学方程

2.4 对焦化废水中吡啶的降解

菌株B1对焦化废水的处理效果见图6。由图6可见，在反应开始约30 h内，4种加菌方式的吡啶降解效果均不好，原因可能是焦化废水中污染物成分多、毒性较大，菌种适应期较长；在随后的40～54 h内，各加菌方式的降解效果逐渐拉开差距，以加菌方式4）的吡啶降解效果最好，在降解时间为54 h时剩余吡啶质量浓度即达到119.53 mg/ L。这是因为，菌株B1适应了环境，且菌株B1和活性污泥中的微生物可能经过协同效应共同代谢底物，加快了吡啶的降解。在降解时间为54～74 h时，加菌方式4）对吡啶几乎没有降解，这可能是因为在菌株B1和活性污泥中含有的其他菌种的协同作用下，废水中的有机物被大量去除，造成微生物碳源不足，使得吡啶降解率没有持续增大。在降解时间为74 h时，加菌方式2）与4）的剩余吡啶质量浓度相同，达到110.7 mg/L，吡啶降解率为74.26%，说明菌株B1在单菌作用时即对吡啶有较好的降解效果。

图6 菌株B1对焦化废水的处理效果

3 结论

a）以吡啶作为唯一碳源，从焦化废水活性污泥中分离筛选得到一株吡啶降解优势菌B1，结合菌落形态、生理生化实验结果及16S rDNA测序对比结果，鉴定菌株B1为革兰氏阴性不动杆菌属（Acinetobactersp.）细菌。

b）通过单因素实验得到菌株B1的最佳降解条件：降解温度30 ℃，初始pH 为7，摇床转速150 r/ min。

c）菌株B1对吡啶的降解符合零级动力学方程。当初始吡啶质量浓度为300 mg/L时，菌株B1对吡啶的降解速率常数最大，达21.103 mg/（L·h）。

d）菌株B1能在初始吡啶质量浓度为430 mg/L的实际焦化废水中良好生长，反应74 h后的吡啶降解率达74.26%。

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［11］ 庹保华. 典型氮杂环化合物高效降解菌的分离鉴定、降解特性及代谢途径研究［D］. 武汉：武汉科技大学，2012.

（编辑 叶晶菁）

采用溶剂提取工艺将难处理炼油污泥变废为宝

Chem Eng，2015，122（7）：7

一项采用低沸点溶剂萃取工艺的工业化项目已经开始施工，用于回收炼油厂流化催化裂化单元（FCCUs）产生的废催化剂粉末和难处理污泥中的淤浆油。

据开发商Cat精细化管理技术有限责任公司（CFMT）称，该工艺可使炼油厂从本将被浪费掉的废物中分离出两种有价物质: 可用作FCCUs平衡催化剂的粉末催化剂材料，以及可用作生产碳黑和针状焦的优级原料的淤浆油。

当催化剂粉末（细粉）通过FCCU旋风分离器逸出并累积在淤浆油流中，形成一种被比喻为“在糖浆中的滑石粉”的污泥。该污泥被分类为环境保护局（EPA）的资源回收和保护法案（RCRA）列出的K-170危险废弃物，并导致了“业务中最艰难的油箱清洗工作”。

目前这种污泥材料的处理方法是将淤浆油存储罐底油泥采用光循环油（LCO）工艺稀释，然后离心分离混合物。这种方法有缺点，因为回收的油含有大量固体污染物，而目前的方法仍然会以反洗催化剂细粉的形式产生K-170废弃物，它们必须通过包括焚烧、填埋和水泥窑等成本高昂的方法处理。

CFMT已开发出一种可集成到淤浆油过滤系统中的工艺，可将该反洗物流处理成为可回收平衡催化剂（以干粉的形式），并100%回收与细粉混在一起的淤浆油。四部分的模块化过程开始于消解槽，溶剂掺混物与污泥物料在其中混合并搅拌。然后，溶解的淤浆油被倾析出而残余物经过滤分离出固体催化剂颗粒。将溶剂-湿催化剂进行干燥，溶剂从油中蒸发出来，两者都被回收。溶剂使该材料呈现为可过滤性而无需提高温度，因而节约了能源。

一座5 t/d的原型示范装置已经开始建设。该装置位于德克萨斯州SanLeon基地，不久将用于处理K-170废弃物。该装置于2015年7月启动。

（以上由赵淑战供稿）

Screening of a Pyridine-Degrading Strain and Its Biodegradation Capability

Chen Pei1，Yan Jiabao2，Yu Yongdeng1
（1. School of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China；2. Academic Administration Off ce，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China）

Using pyridine as sole carbon source，a high-efficient pyridine-degrading strain B1 was separated from activated sludge of coking wastewater，and was identified. The optimum degradation conditions were investigated by signal factor experiments. The reaction process was described by kinetics equations. And the degradation effect of pyridine in coking wastewater by strain B1 was examined. The experimental results show that：The strain B1 is gramnegative bacterium identif ed as gram-negativeAcinetobactersp.；The optimum degradation temperature，initial pH and stirring speed is 30 ℃，7 and 150 r/min respectively；The pyridine degradation process follows the zero-order kinetics model，and when the initial pyridine mass concentration is 300 mg/L，the degradation rate constant is up to 21.103 mg/（L·h）；After the actual coking wastewater with 430 mg/L of initial pyridine mass concentration has been treated for 74 h，the pyridine degradation rate can reach 74.26%.

pyridine；strain screening；degradation；coking wastewater；kinetics

X784

A

1006-1878（2015）06-0566-05

2015 - 07 - 16；

2015 - 07 - 30。

陈佩（1990—），女，湖北省仙桃市人，硕士生，电话 15907122564，电邮 504532896@qq.com。

湖北省自然科学基金重点项目（2011CDA054）；武汉科技大学研究生创新创业基金重点项目（JCX0006）；武汉科技大学国家级大学生创新创业训练计划项目（201310488009）。