碰碰香高效离体再生体系的建立

张娜

（山西省林业科学研究院，山西 太原030012）

碰碰香（Plectranthustomentosa），又名延命草、绒毛香茶菜，属唇形科香茶菜属多年生灌木状草本植物［1］。因触碰后可散发出令人舒适的香气而享有“碰碰香”的美称；又因其香味浓甜，颇似苹果香味，故又享有“苹果香”美誉。作为盆栽观赏，可放置高处或悬吊在室内，备受市场青睐。其叶片可泡茶、酒，奇香诱人，具有提神醒脑、清热解暑、驱避蚊虫功效［2］。

碰碰香一般采用播种或扦插繁殖方法进行繁殖，但播种方法周期长，且容易发生变异，其优良性状不易保持。目前有关于碰碰香水培扦插繁殖方面的研究报道［3］，但扦插繁殖容易引起病毒的积累，导致观赏品质降低。因此，寻求一种高效、快速的繁殖方法是碰碰香生产中亟需解决的技术难题。组织培养因其培养周期短、繁殖速度快、苗木规格一致，是快速、大规模繁殖碰碰香的必然选择。

目前尚未发现碰碰香组织培养方面的研究报道。本研究以碰碰香幼嫩茎段作为外植体，对碰碰香腋芽诱导、增殖培养及生根培养的影响因素进行研究，旨在建立高效、完善的碰碰香离体培养再生体系，为大规模、快速繁殖碰碰香优良品种提供技术支持，也为其它观赏植物的组培快繁提供技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择植株生长健壮的碰碰香幼嫩茎段作为外植体材料。

将茎段洗净后，在超净工作台上，先用75%的酒精灭菌10～30s，无菌水冲洗3次，再用0.1%氯化汞（HgCl2）进行不同时间的灭菌处理后，无菌水冲洗5～6次，并切成1.5cm左右的茎段，每个茎段至少带一个腋芽，准备接种。

1.2 试验方法

1.2.1 灭菌时间对碰碰香茎段消毒的影响

本试验采用0.1%HgCl2作为灭菌剂，灭菌时间梯度分别为3、4、5和6min。外植体经灭菌处理后接种培养于MS培养基中，每处理均为30瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次，4周后对污染率、死亡率和成活率进行观察统计。

1.2.2 基本培养基对碰碰香茎段腋芽诱导的影响

采用MS、B5和WPM3种培养基作为基本培养基，每处理均为30瓶，重复3次，接种培养4周后，观察碰碰香腋芽生长情况，统计诱导率，筛选碰碰香腋芽诱导的最佳基本培养基。

1.2.3 BA浓度对碰碰香试管苗增殖的影响

采用上述筛选的最佳基本培养基作为基本培养基，添加0.2mg·L－1NAA，再添加不同浓度的BA，具体浓度为0.5、1.0、2.0、3.0mg·L－1，每处理均为30瓶，重复3次，培养4周后，观察试管苗增殖情况，统计增殖率和增殖系数。

1.2.4 生长素对碰碰香试管苗生根的影响

将继代增殖的试管苗转接于1／2MS基本培养基，并分别添加不同浓度（0.5，1.0，2.0mg·L－1）的NAA和IBA，未添加生长素的培养基作为对照，每处理均为30瓶，重复3次，4周后统计生根率，筛选碰碰香的最佳生根培养基。

1.2.5 炼苗移栽

选取90株生长健壮的生根苗进行炼苗移栽。首先将其放置生长室进行炼苗，两周后从锥形瓶中取出生根苗，洗净根部的培养基，然后移栽到含有土壤、沙子和泥炭的混合基质（1∶1∶1）中，在温室条件下生长。30d后统计移栽成活率。

1.3 培养条件

所有培养基中均添加蔗糖3%，琼脂0.45%，pH调至5.8～5.9，121℃高压灭菌15min。所有培养物均培养于25±2℃培养室，光照强度为2500lx～3000lx，光照时间为14～16h·d－1。

1.4 数据统计

将所有数据采用SPSS统计软件进行方差分析，并采用Duncan多重比较方法进行显著性检验。具体指标计算如下：

污染率 ＝ 污染的外植体数／接种的外植体总数×100%

死亡率 ＝ 死亡的外植体数／接种的外植总体数×100%

成活率＝1－污染率－死亡率

腋芽诱导率 ＝ ［诱导出腋芽的外植体总数／（接种的外植体总数－污染的外植体数）］×100%

增殖率 ＝ 出现增殖芽数／总接种芽数×100%

增殖系数 ＝ 增殖后总芽数／发生增殖的芽数

生根率 ＝ 生根的芽数／接种总数×100%

2 结果与分析

2.1 灭菌时间对碰碰香茎段外植体灭菌效果的影响

方差分析表明，灭菌时间对外植体污染率、死亡率和成活率均有极显著影响（P＜0.001）。

表1 灭菌时间对茎段外植体灭菌效果的影响Table 1 Effect of treatment time on disinfection of stem segment explants

当灭菌时间为3min时，污染率较高，成活率仅为65.4%；随着灭菌时间的延长，污染率逐渐降低；当灭菌时间为4min时，污染率和死亡率均较低，成活率最高，达86.9%；当灭菌时间延长为5 min时，污染率较低，为8.5%，但死亡率较高，达22.3%，成活率仅为69.2%；继续延长至6min时，污染率最低，为5.5%，但死亡率最高，达42.6%，成活率相对较低，仅51.8%，主要是由于灭菌时间过长所致（表1）。由此可见，4min是碰碰香茎段外植体的最佳灭菌时间。

2.2 基本培养基对碰碰香茎段腋芽诱导的影响

方差分析表明，不同基本培养基对碰碰香茎段腋芽诱导效果影响显著（P＝0.022）。3种基本培养基中，MS基本培养基的腋芽诱导率最高，达95.9%，腋芽萌发时间较早，在5～6d即开始萌发，叶片伸展较快，植株长势良好。B5和WPM培养基中腋芽诱导率略低，分别为90.4%和86.1%，腋芽萌发时间较晚，均在7～8d开始萌发，而且植株长势细弱，叶片伸展较慢（表2）。由此可见，MS培养基是碰碰香茎段腋芽诱导的最适基本培养基。

表2 基本培养基对腋芽诱导的影响Table 2 Effect of basal medium on induction of axillary bud

2.3 BA浓度对碰碰香试管苗增殖的影响

方差分析表明，不同BA浓度对碰碰香试管苗增殖率和增殖系数差异显著（分别为P＝0.004和P＝0.041）。当BA浓度为0.5mg·L－1时，试管苗增殖率为85.3%，增殖系数达6.4；当BA浓度提高到1.0mg·L－1时，试管苗增殖率和增殖系数均达到最高，分别为96.3%和12.9。随着BA浓度的升高，增殖率和增殖系数呈下降趋势。BA浓度提高至 2.0mg·L－1时，试管苗增殖率达90.9%，增殖系数为9.7，而且试管苗出现轻微玻璃化现象；当BA浓度继续提高至3.0mg·L－1时，增殖率和增殖系数均较低，分别为83.7%和7.3，而且试管苗玻璃化现象加剧（表3）。由此可见，培 养 基 中 添 加 1.0mg·L－1BA 和 0.2 mg·L－1NAA为碰碰香试管苗的最佳增殖培养基。

表3 BA浓度对试管苗增殖的影响Table 3 Effect of different concentrations of BA on shoot proliferation

2.4 生长素对碰碰香试管苗生根的影响

试验发现，当培养基中未添加生长素或单独添加NAA或IBA时，试管苗均能生根，不同培养基间的生根率存在显著差异（P＝0.002）。

当培养基中未添加任何生长素时，生根率达90.3%，根系细弱，试管苗长势较弱。当培养基中添加NAA时，生根率显著提高，根系粗壮，试管苗长势良好。当添加0.5mg·L－1NAA时，生根率达95.0%；NAA浓度提高到1.0mg·L－1时，生根率最高，达99.3%；继续提高NAA浓度至2.0 mg·L－1时，生根率略有降低（表4）。

当培养基中添加IBA时，生根率与对照相比也显著提高，但根系细弱，试管苗长势较弱。当IBA浓度为1.0mg·L－1时，生根率最高，达96.1%；IBA浓度高于或低于1.0mg·L－1时，生根率均略有降低（表4）。由此可见，培养基中添加1.0mg·L－1NAA是碰碰香试管苗的最佳生根培养基。

2.5 炼苗移栽

生根苗经炼苗后移栽至温室，生长30d后，移栽成活率高达94.2%，且生长表现正常。

3 结论与讨论

有效控制外植体污染是植物组织培养成功的先决条件［4］。适宜的灭菌时间既能达到良好的灭菌效果，又对外植体的损伤较小。本研究采用0.1%HgCl2作为灭菌剂，设置了4个梯度对灭菌时间进行筛选，研究结果表明，4min是碰碰香茎段外植体的最佳灭菌时间。高建莉等［5］对长寿花幼茎外植体进行灭菌试验发现，采用0.1%HgCl2消毒10min是长寿花幼茎外植体的最佳灭菌时间。王大平［6］对常绿欧洲荚蒾茎段进行灭菌试验发现，0.1%HgCl2消毒8min是常绿欧洲荚蒾茎段的最佳灭菌时间。由此可见，不同植物茎段外植体的最佳灭菌时间不尽相同。

表4 生长素对试管苗生根的影响Table 4 Effect of different auxins on rooting of in vitro regenerated shoots

基本培养基的选择直接影响茎段外植体的腋芽诱导效果。本研究结果表明，在MS基本培养基中，腋芽诱导率最高，达95.9%，腋芽萌发时间较早，叶片伸展较快，植株长势良好。B5和WPM培养基的腋芽诱导率略低，腋芽萌发时间较晚，而且植株长势细弱，叶片伸展较慢。可能是由于MS基本培养基中的无机盐含量高，尤其是硝酸盐、铵离子和钾离子含量丰富，更适宜碰碰香腋芽诱导及生长［4］。何克勤等也采用MS基本培养基对甜叶菊茎段外植体进行腋芽诱导［7］。

基本培养基需要配合使用适当的植物生长调节剂才能诱导细胞分裂的启动、培养物形态建成、芽和根的分化与发育等［8］。本试验采用不同浓度BA与0.2mg·L－1NAA组合对碰碰香试管苗进行增殖试验研究，发现BA浓度为1.0mg·L－1时，试管苗增殖率和增殖系数最高，是碰碰香试管苗的最佳增殖培养基。高建莉等［5］研究发现，长寿花茎段的最佳增殖培养基为 MS添加1.0mg·L－1BA与0.1mg·L－1NAA。

培养基中添加适当浓度的生长素有利于根的形成和生长。一般常用的生长素包括NAA和IBA［4］。本研究结果表明，IBA对碰碰香试管苗的生根效果不及NAA生根效果好。培养基添加1.0mg·L－1NAA 的生根率最高，达99.3%，根系粗壮，试管苗长势良好；而在添加IBA的培养基中，生根率也较高，但根系细长，试管苗长势较弱。Alam I等［9］对蓖麻试管苗的生根研究表明，NAA的生根效果更佳。笔者在进行文冠果试管苗生根研究时发现，IBA更适宜文冠果试管苗生根诱导。可见，不同植物种类需要不同的生长素用于诱导生根。

［1］孔维维，吕鼎豪，李华，等.碰碰香不同部位挥发性成分的分析［J］.药物分析杂志，2013，33（2）：241－245.

［2］熊伟，金荷仙，蔡宝珍.碰碰香挥发物化学成分分析［J］.浙江农林大学学报，2011，28（4）：680－684.

［3］马振翠，姚洪庆，郭明明，等.碰碰香水培扦插繁殖技术研究［J］.黑龙江农业科学，2014（11）：96－98.

［4］王蒂 .植物组织培养［M］.北京：中国农业出版社，2004：29.

［5］高建莉，王定开.长寿花组织培养技术研究［J］.云南农业科技，2009，（5）：11－13.

［6］王大平.常绿欧洲荚蒾离体繁殖的启动和增殖培养研究［J］.江苏农业科学，2011，39（5）：67－68.

［7］何克勤，胡能兵，崔广荣，等.甜叶菊茎段腋芽诱导培养基和NaN3诱变条件筛选及诱变试管苗POD同工酶分析［J］.植物资源与环境学报，2012，21（3）：74－79.

［8］谭文澄，戴策刚 .观赏植物组织培养［M］.北京：中国林业出版社，1991：117.

［9］Alam I，Sharmin S A，Mondal S C，et al.In vitromicropropagation through cotyledonary node culture of castor bean （Ricinuscommunis L.）［J］.Aust J Crop Sci，2010，4：81－84.