肾虚质大鼠学习记忆与BDNF表达的实验研究＊

孙理军 孙耀光 王晓棣 王 兴 孙瑜嬬 张 琪 陕西中医药大学（咸阳712046）

肾藏精舍志、主骨、生髓、通脑，历代医家无论从理论探讨，还是临床实践方面，均认为肾虚体质的一个重要表现特征是学习记忆能力的减低［1］。大量研究证实记忆和意志等中枢神经功能涉及海马等与生命体精神心理调节密切相关的脑区。BDNF通路具有调节海马突触传递和突触可塑性的作用，通过诱发并维持海马、皮质长时程增强效应（Long－term Potentiation，LTP），参与中枢神经功能，是判断肾虚体质的重要指标。

1 材料与方法 1.1 实验动物 8周龄清洁级SD雌、雄大鼠（体重200～240g），购自西安交大医学院实验动物中心（生产许可证SCXK（陕）2007－001）。标准饲料喂食，不限饮水，室温。雌雄土猫各1只，3月龄，凶狠善叫，鲜活大鼠喂食，不限饮水，室温。

1.2 实验主要药物、试剂及仪器 左归丸（批号：100306）、右归丸（批号：110309）、水合氯醛、RIPA蛋白裂解液试剂盒、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒、SDS－PAGE凝胶试剂盒、脱脂牛奶、TBST、BDNF、TrkB、CaMK2、CREB一抗、二抗、ECL化学反应发光试剂盒（均购自勇毅试剂公司）；特制猫、鼠笼、电子精密天平、低温高速离心机（北京时代北利公司）、恒温箱、酶标仪（562nm）、电泳仪（美国BioRad公司）、凝胶成像仪（上海复日科技）等。

1.3 动物分组及模型建立［2］适应性饲养1周后，按雄性与雌性大鼠1∶2比例合笼交配。成功受孕后将孕母鼠随机分为对照组（n＝10）和肾虚组（n＝10）。肾虚组孕鼠置于特制鼠笼，于早8：00至晚7：00置于猫笼旁进行恐吓，同时在猫笼内放置雄鼠令其捕食使孕鼠在旁处于恐慌状态；对照组孕鼠不作处理，非恐吓时间两组均置于同处并确保其他非处理因素一致。恐吓至两组孕鼠产子，将仔鼠饲养4周进行分组，空白组（n＝10）从对照孕鼠所产仔鼠中随机选取；肾虚组孕鼠所产仔鼠随机选取30只，分为模型组（n＝10）、左归丸（n＝10）、右归丸组（n＝10），继续对此三组仔鼠进行恐吓并持续1个月。空白组仔鼠零刺激，非恐吓时间四组仔鼠均置同处减小非处理因素。

1.4 给药方法与剂量 按文献折算［3］，大鼠用药量约为人6.25倍。左归丸每10丸含生药量1g，成人每日服生药18g，则大鼠每日服生药为1.875g／kg，蒸馏水配成1.875g／mL混悬液备用。右归丸每8丸含生药3g，成人每日服生药9g，则大鼠每日服生药为0.9375g／kg，蒸馏水配成0.09375g／mL混悬液备用。对仔鼠恐吓同时开始灌胃，药物组给予上述制备好的混悬液，空白组和模型组给予等量生理盐水10mL／kg，1d1次，每周用药5d停2d，连续2月。

1.5 Morris水迷宫实验 各组仔鼠5周龄时进行Morris水迷宫实验，实验第1天为适应训练，每只仔鼠在池中游泳120秒。第2～5天为学习阶段，随机选取一象限将大鼠头朝池壁缓缓放入水中，记录大鼠找到水下平台时间，若超过60s未找到者，则引导至平台停留10s，每只大鼠4次／d，中间间隔15～20min。实验第6天为测试阶段：将大鼠分别从四个不同象限放入水中，找到平台后令其休息10s，若120s内找不到平台则记时120s并将其引致平台休息10s，从下一象限继续试验，以大鼠四次测试平均值做为测试成绩，记录各组大鼠寻找平台所花费的时间即潜伏期（s）、总路程（cm）和第一次穿越目标区所用时间（s）。

1.6 免疫印迹实验 首先提取海马组织蛋白，仔鼠用药2个月后禁食12h称重，7%水合氯醛0.05mL／kg腹麻，断头冰上取海马称重，按照RIPA蛋白裂解试剂盒制备裂解液并加入13μL／mg裂解液冰上匀浆，12000rpm 4℃离心10min，取上清分装，－80℃冻存。然后进行相关准备及检测。

1.6.1 蛋白定量检测：BCA蛋白定量试剂盒检测：冰浴上制备好准备液和标准品，96孔板上25μL／孔依次加入标准品并做两个复孔，等量去离子水做空白对照，等量10倍去离子水稀释蛋白样品上样；每孔加200μL配置好的BCA混合工作液，混匀后37℃孵育30min；酶标仪562nm读取吸光值计算蛋白浓度；loading buffer稀释样品使其终浓度5μg／μL。

1.6.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：配置10%分离胶和4%积层胶，待胶凝固后加入Maker和样品各15uL；按60V电压分离胶和90v电压积层胶电泳。

1.6.3 转膜：按顺序组装转膜装置，冰浴380A转膜约1.5h；取出PVDF膜，1%丽春红染色后现清晰、连续粉红色条带；去离子水洗去丽春红，将膜放入ddH2O平皿中，摇床80rpm震荡清洗5min。

1.6.4 抗体杂交：将膜置入TBST配置的5%脱脂奶粉平皿中摇床震荡，室温封闭1h；塑料袋加入1∶150比例TBST稀释一抗，PVDF膜置入塑料袋封口，4℃冰箱过夜；取出膜清洗，加入TBST 1∶1000稀释的二抗封口，摇床室温封闭1h。

1.6.5 发光检测：ECL发光试剂盒避光制备发光工作液，暗室中压片、显影液显影、清洗后定影；凝胶成像仪照相、全自动摄影仪拍摄扫描并测定光密度值。

1.7 统计学方法 将蛋白灰度值与内参β－actin灰度值比 较，得 出 BDNF／β－actin、TrkB／β－actin、CaMK2／β－actin 和CREB／β－actin比值，反应各样品中蛋白的表达水平。SPSS16.0软件统计分析，结果均用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 肾虚质大鼠学习记忆的变化（Morris水迷宫实验） ①潜伏期：模型组长于空白组、左归丸、右归丸组（P＜0.05）；左归丸、右归丸组间差异无统计学意义（P＞0.05）。②总路程：模型组长于空白组、左归丸、右归丸组（P＜0.05）；左归丸、右归丸组间无统计学意义（P＞0.05）。③第一次穿越时间：模型组略长于其他三组，与右归丸组相比差异有显著性（P＜0.05）；但与空白组和左归丸组相比没有统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 Morris水迷宫参数比较（±s，n＝10）

表1 Morris水迷宫参数比较（±s，n＝10）

42.9±3.1 719.2±50.9 16.9±0.9模型组 65.3±10.7 1184.4±116.3 18.1±1.8左归丸组 44.2±8.6 916.5±160.5 17.3±2.5右归丸组）空白组48.7±9.1 813.3±140.4 16.2±2.1

2.2 肾虚质大鼠海马BDNF、TrkB、CREB和CaMK的表达变化 使用免疫印迹法对各组大鼠的海马组织的BDNF、TrkB、CREB和CaMK的表达进行分析，如图1所示，肾虚质模型组的海马BDNF、TrkB、CaMK2及CREB表达均出现下调，而左归丸及右归丸干预后2组大鼠的BDNF、TrkB、CaMK2及CREB表达出现部分升高。对各组蛋白的表达进行定量分析，如表2所示，与空白组比较，模型组BDNF、TrkB、CaMK2、CREB蛋白表达均显著下降（P＜0.05）；左归丸组的BDNF、TrkB、、CREB略高于模型组但无统计学差异（P＞0.05），CaMK2显著高于模型组（P＜0.05）。右归丸组BDNF、TrkB、CREB高于对照组但无统计学差异（P＞0.05），CaMK2显著性高于模型组（P＜0.05）。左、右归丸组间比较无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 海马BDNF、TrkB、CREB和CaMK的含量变化（±s，n＝10）

表2 海马BDNF、TrkB、CREB和CaMK的含量变化（±s，n＝10）

0.75±0.22 0.62±0.21 1.03±0.05 0.88±0.24组别 BDNF／β－actin TrkB／β－actin CaMK2／β－actin CREB／β 0.92±0.12 0.89±0.30 1.14±0.07 0.97±0.22模型组 0.59±0.22 0.58±0.22 0.53±0.06 0.83±0.26左归丸组 0.79±0.23 0.72±0.23 1.01±0.05 0.91±0.30右归丸组－actin空白组

3 讨 论 肾虚体质是各类人群常见的体质类型之一，是以肾中精气亏虚，肾脏功能低下为主要特征的一种体质状态。肾藏精舍志、主骨、生髓、通脑，历代医家无论从理论探讨，还是临床实践方面，均认为肾虚体质的一个重要表现特征是学习记忆能力的减低。学习和记忆过程的基础是神经元之间的连接，即突触在形态和功能上的改变，脑源性神经营养因子（BDNF）具有防止神经元死亡的功能，是神经营养因子的一种，主要由大脑皮质和海马的神经元产生；酪氨酸激酶B（TrkB）为BDNF的特异性受体，当BDNF与TrkB结合可调节神经营养信号［4］。研究阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）模型大鼠的实验发现，钙／钙调素依赖的蛋白激酶II（CaMK II）－α与 AD关系密切［5］。CaMK II－β蛋白参与突触构建过程，促进学习记忆的恢复，CaMLII－β降低表达则造成认知功能障碍［6］。cAMP反应元件结合蛋白（CREB）作为核内重要的转录因子，其本身也可被BDNF激活，增强CREB功能可明显增强动物的长期记忆能力［7］。

实验结果显示，肾虚质大鼠海马BDNF蛋白表达下降，其相关信号分子TrkB、CaMK2、CREB亦出现一定程度的降低，补肾方药左归丸、右归丸在一定程度上可以上调其下降的异常表达，证明补肾中药在肾虚质脑功能减退方面可通过改善神经营养因子低表达使其恢复正常从而起到改善肾虚质衰退的脑功能。提示肾虚质大鼠学习记忆与海马BDNF及其相关分子的表达变化，是肾藏志理论的重要神经生物学重要指标。对于预防亚健康状态的产生以及对老年性脑功能疾病和多种慢性疾病的防治具有重要的理论价值和现实意义。

［1］ 薛 昶，孙理军，郝 蕊.肾虚体质大鼠生理指标变化的实验研究［J］.陕西中医，2008，29（4）：505－506.

［2］ 孙理军，李翠娟，王 震，等.肾虚质实验动物模型的构建方法与评价［J］.时珍国医国药，2013，24（1）：247－249.

［3］ 施新猷.现代医学实验动物学［M］.北京：人民军医出版社，2000：332－335.

［4］ Kilein R，Nanduri V，Jing SA，et al.The trkB tyrosine protein kinase is a receptor for brain－derived neurotrophic factor and neurotrophin－3［J］.Cell，1991，66：395－403.

［5］ 胡 慧，王 平，孔明望，等.补肾化痰方药对阿尔茨海默病模型大鼠脑组织钙／钙调素依赖的蛋白激酶II－α活性的影响［J］.中华中医药杂志，2010，25（5）：786－787.

［6］ 唐敬龙，高维娟，李玉明，等.补阳还五汤对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马组织ERK2与CaMK IIβ蛋白表达的影响［J］.中国病理生理杂志，2010，26（9）：1722－1727.

［7］ Yin JC，Del Vecchio M，Zhou H，et al.CREB as a memory modulator：induced expression of a dCREB2activator isoform enhances long－term memory in Drosophila［J］.Cell，1995，81（1）：107－115.