上海3所妇产科医院白念珠菌基因同源性分析

应春妹， 张红菊， 唐振华， 陈慧芬， 高 晶， 蒋南燕

·论著·

上海3所妇产科医院白念珠菌基因同源性分析

应春妹1， 张红菊1， 唐振华2， 陈慧芬3， 高 晶1， 蒋南燕1

目的 了解上海地区白念珠菌主要基因型，为监测和诊治临床白念珠菌感染提供实验依据。方法 收集2013年11月—2014年1月复旦大学附属妇产科医院、国际和平妇幼保健院和上海市第一妇婴保健院3所医院阴道炎患者阴道分泌物分离的白念珠菌共115株，随机扩增多态性DNA检测其基因型，ATB FUNGUS 3试剂盒检测5种抗真菌药物最低抑菌浓度。结果 随机扩增多态性DNA结果显示，115株菌分为A、B、C 3型，其中A型89株(占77.4%)又分5个亚型，B型22株(占19.1%)分为2个亚型。C型4株(占3.5%)。115株白念珠菌对5-氟胞嘧啶敏感率为96.5%；对两性霉素B敏感率为100%；对氟康唑敏感率为85.2%；对伊曲康唑敏感率为55.7%；对伏立康唑敏感率为84.3%。结论 上海地区3所医院分离的白念珠菌基因型没有明显区别, 同源性分型主要以A型为主。药敏试验显示，该地区白念珠菌对5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伏立康唑敏感率较高。

白念珠菌； 随机扩增多态性DNA； 同源性分析

念珠菌性阴道病是一种常见的妇科疾病，是局部黏膜念珠菌过度生长致菌群生态紊乱引起。国内外的流行病学研究表明，念珠菌是继细菌之后引起妇女阴道炎的主要病原真菌，其中80%～95%系由白念珠菌引起[1]。本研究应用随机扩增多态性DNA(RAPD),对上海复旦大学附属妇产科医院、国际和平妇幼保健院和上海市第一妇婴保健院3所妇产科专科医院分离的白念珠菌进行基因分型，以了解上海地区白念珠菌主要基因型，为监测和诊治临床白念珠菌感染提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集2013年11月—2014年1月分离的115株白念珠菌，其中复旦大学附属妇产科医院59株、国际和平妇幼保健院30株和上海市第一妇婴保健院26株，均为阴道炎患者阴道分泌物标本中分离获得。

1.1.2 培养基 科玛嘉显色平皿(上海科玛嘉微生物技术有限公司)。酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(yeast extract peptone dextrose medium，YPD，上海生工科技有限公司)。

1.1.3 试剂盒 酵母样真菌药敏试剂盒(ATB FUNGUS 3，法国生物梅里埃公司)。DNA抽提试剂盒(BioFlux公司)。聚合酶链反应(PCR)试剂(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 白念珠菌鉴定与保存 标本收集后立即接种于YPD琼脂平皿和科玛嘉显色平皿，置35 ℃、5% CO2孵育箱中培养24～48 h后，YPD琼脂平皿上，菌落呈奶酪色，表面湿润、光滑，边缘整齐，科玛嘉显色平皿上呈翠绿色。涂片镜检，见镜下圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝，则鉴定为白念珠菌。菌株保存于YPD液体培养基，-80 ℃保存。

1.2.2 白念珠菌 DNA提取 按DNA提取试剂盒操作(BioFlux公司)。该试剂盒以选择性Biospin膜系统为基础，通过多个步骤的沉淀和重悬提取DNA，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测量核酸浓度。

1.2.3 RAPD检测 实验所需引物为99407(5′-ACG GCC GAC C-3′)[2-3]。50 μL反应体系包括：5 u/μL Taq酶(TaKaRa公司)0.25 μL，无Mg2+的10×PCR缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3; 500 mmol/L KCl)5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，dNTP混合物(各2.5 mmol/L)4 μL，10 μmol/L的引物4 μL，模板DNA 1 μL和32.75 μL双蒸水。扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 2 min，36 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环40次；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。取PCR产物，1 %琼脂糖凝胶电泳25 min。

1.2.4 抗真菌药敏试验 挑取生长良好的单个菌落，用ATB FUNGUS 3试剂盒鉴定。该试剂盒包括5种抗真菌药物：5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑。质控菌株为近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258。药敏结果按照CLSI M27-A3折点判断[4]。

1.2.5 数据分析 采用NTsys 2.10e软件包实现条带结果的聚类分析，在相似系数0.80水平进行分析。

2 结果

2.1 RAPD检测结果

115株菌分为A、B、C 3型，其中A型89株，占77.4%，又分5个亚型；B型22株，占19.1%，分为2个亚型；C型4株，占 3.5%。白念珠菌RAPD指纹图见图1。3所医院分型结果如下：复旦大学附属妇产科医院59株白念珠菌中A型45株(包括A1A5型)、B型10株(B1、B2型)、C型4株；国际和平妇幼保健院30株白念珠菌中A型23株(包括A1A4型)，B型7株(B1、B2型)；上海市第一妇婴保健院26株白念珠菌中A型21株(包括A1A3型、A5型)，B型5株(B1、B2型)，见表1。

M: DNA Marker; T1-T8:Candidaalbicansstrains

图1 白念珠菌RAPD指纹图

2.2 药敏试验结果

依据CLSI M27-A3判断标准，5种抗真菌药物最低抑菌浓度(MIC)折点范围见表2。115株白念珠菌对5-氟胞嘧啶敏感率为96.5%，对两性霉素B敏感率为100%，对氟康唑敏感率为85.2%，对伊曲康唑敏感率为55.7%，对伏立康唑敏感率为84.3%，见表3。

表2 5种抗真菌药物MIC折点范围

表3 115株白念珠菌对5种抗真菌药物敏感率

3 讨论

本研究通过RAPD检测及聚类分析将115株白念珠菌分为A、B、C 3型，其中A型又分5个亚型，B型分为2个亚型，以A型为主，占77.4%。3所妇产科医院分型较一致，均以A型为主，C型仅在复旦大学附属妇产科医院分离到，其他2所医院未见C型，说明上海地区白念珠菌主要以A型为主。项明洁等[3]临床分离并保存的120株白念珠菌进行RAPD基因分型，选用引物99407，结果可分为8 型：28株菌为A型，37株菌为B型，21株菌为C型，6株菌为D型，25株菌为E型，3株菌各成一型，分别为O1、O2、O3型。从医院水平未发现型别分布呈明显倾向性，而在医院的病区型别分析中，发现血液科主要为A 和C 型，肺科主要为A、B 和E 型。从南京市第一医院妇产科和中国协和医科大学皮肤病研究所门诊收集并分离阴道分泌物标本的97株念珠菌中，85.6%为白念菌株。RAPD扩增结果表明，引物4和引物7均可将来源于不同临床分型的97株菌及2株标准菌株分别分成19型和21型。其中应用引物4的主要分型结果为A1型20株，B1型20株，C1型23株；其中应用引物7的主要分型结果为A2型52株，B2型7株，C2型9株，以A2型为主[5]。从巴西东北部患念珠菌性阴道病妇女阴道分泌物中分离得到的62株白念珠菌，用RAPD法进行基因分型，A型最为普遍，占93.6%，其次是C型，占6.4%，而没有发现B型[6]。在泰国艾滋病患者分离得到的白念珠菌，用RAPD法进行分型，将87株白念珠菌分成了14型，主要集中在10个型中，说明泰国的白念珠菌有着丰富的多样性[7]。

念珠菌基因分型主要有RAPD检测、脉冲场凝胶电泳、多位点序列分型和单链构象多态性分析等方法。脉冲场凝胶电泳虽是念珠菌基因分型金标准方法，但因其操作烦琐，研究人员需掌握一定的分子检测技术，在临床较少使用。多位点序列分型是近年来发展的新的分子生物学分型方法，通过分析多个管家基因内部片段的核苷酸序列对病原菌进行基因分型，通过多位点序列分型数据库能对不同实验室及不同国家的分析结果进行比较[8]。RAPD检测的分型结果可因不同引物或选取不同的相似系数而产生不同的分型结果，如Noumi等[2]的研究以相似系数75%水平为标准进行分型，将25株白念珠菌分成Ⅰ、Ⅱ 2型，其中Ⅱ型又分成A、B 2型。Ben Abdeljelil 等[9]使用RAPD方法研究时发现，不同水平相似系数下所分型别也有所不同，在相似系数为69%水平分型时，90株白念珠菌分成Ⅰ、Ⅱ 2型；在相似系数为100%水平时，可分成29个型，其中84.8%集中在15个型中。但该方法检测分型能力强、简便、快速、成本较低，在念珠菌基因分型中应用较广[10-11]，对监测白念珠菌的医院感染来源以及流行病学调查方面依然是较实用的检测方法。

白念珠菌是引起妇女阴道炎的主要病原之一，念珠菌性阴道病广泛影响着育龄期妇女的健康。对白念珠菌的耐药性进行分析，能够指导临床用药。唑类抗真菌药物是念珠菌病治疗的常规用药，与两性霉素B相比，毒性及不良反应小。本实验对115株白念珠菌作体外药敏试验，结果显示白念珠菌对两性霉素B敏感率为100%，对5-氟胞嘧啶敏感率为96.5%，对唑类抗真菌药物的敏感率也较高，其中氟康唑和伏立康唑敏感率均在85%左右，在临床上仍有良好应用前景。

本研究应用RAPD分型方法检测了3所妇产科专科医院115株白念珠菌基因型，对了解上海地区白念珠菌分子流行病学特征具有重要意义，为临床白念珠菌监测和诊治提供实验依据。

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Homology analysis of theCandidaalbicansstrains collected from three Obstetrics and Gynecology Hospitals in Shanghai by genotyping

YING Chunmei, ZHANG Hongju, TANG Zhenhua, CHEN Huifeng, GAO Jing, JIANG Nanyan

. (Department of Laboratory Medicine, Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai 200011, China)

Objective To investigate the genotypes and susceptibility ofC.albicansstrains isolated from Obstetrics and Gynecology Hospitals in Shanghai. Methods A total of 115 clinical isolates ofC.albicanswere collected from Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, International Peace Maternity and Child Health Hospital and Shanghai First Maternity and Infant Hospital during the period from November 2013 to January 2014. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) was used for genotyping ofC.albicansisolates. Clustering analysis was undertaken using NTsys 2.10e software package. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of 5 antifungal agents were determined by ATB FUNGUS 3 (Biomérieux). Results All the strains tested were grouped into type A, B or C by RAPD. There were 5 subtypes in type A and 2 subtypes in type B. Of the 115C.albicansstrains, 96.5%, 100%, 85.2%, 84.3% and 55.7% were susceptible to 5-flucytosine, amphotericin B, fluconazole, voriconazole and itraconazole, respectively. Conclusions TheC.albicansisolates collected from Obstetrics and Gynecology Hospitals in Shanghai during the period from November 2013 to January 2014 are still highly susceptible to 5-flucytosine, amphotericin B, fluconazole and voriconazole. RAPD genotypes ofC.albicansisolates did not show significant difference among the three hospitals.

Candidaalbicans; random amplified polymorphic DNA; gene homology

上海申康医院发展中心市级医院临床辅助科室能力建设项目(SHDC22014016)。

1. 复旦大学附属妇产科医院检验科，上海 200011； 2. 国际和平妇幼保健院； 3. 上海市第一妇婴保健院。

应春妹(1967—)，女，硕士，主任技师，主要从事细菌耐药性监测和耐药机制研究。

应春妹，E-mail:ycmzh2012@163.com。

R379.4

A

1009-7708(2015)04-0345-04

2014-08-20

2015-02-10