复合生物保鲜剂结合低温贮藏对扇贝柱7种生物胺含量的影响

韩冬娇,吴雪丽,李 敬

(河北农业大学 食品科技学院,河北保定 071000)

复合生物保鲜剂结合低温贮藏对扇贝柱7种生物胺含量的影响

韩冬娇,吴雪丽,李 敬

(河北农业大学 食品科技学院,河北保定 071000)

本文以海湾扇贝柱为研究对象,采用柱前衍生高效液相色谱法将酪胺(Tyr)、腐胺(Put)、尸胺(Cad)、组胺(His)、色胺(Try)、精胺(Spd)、亚精胺(Spm)7种生物胺在20min内进行有效分离,并分析了复合生物保鲜剂结合低温贮藏(0、-5、-20℃)过程中扇贝生物胺种类及含量的变化。结果表明,贮藏温度对扇贝中Cad、Spd、Spm的含量变化差异显著(p<0.05),温度越高,生物胺产生速度越快,Cad、Spm、Spd可作为扇贝贮藏过程中质量变化的参考指标;低温贮藏结合复合生物保鲜剂对扇贝柱中Cad、Spd、Spm的产生有显著的抑制作用。因此,复合生物保鲜剂结合低温贮藏是控制扇贝质量的有效措施。

扇贝,生物胺,复合生物保鲜剂,液相色谱

生物胺(biogenic amines,BAs)是一类含氨脂肪族、芳香族或杂环类具有生物活性的低分子量有机化合物总称,广泛存在于肉制品、水产品、酒类、乳制品与调味品等。生物胺是引起食品安全问题的重要因素之一,其中组胺对身体健康的危害最大,酪胺次之,其他生物胺的存在也会增强组胺和酪胺的毒性,尸胺和腐胺可与硝酸盐生成致癌的亚硝胺[1]。Stuted等[2]发现,当人体摄入组胺超过50mg时,即可引起过敏性中毒。现有研究表明,几种生物胺混合含量过高,会对人体神经和心血管系统造成损伤[3],生物胺可作为水产品鲜度变化指标[4]。扇贝是高蛋白质食物,在加工和贮藏过程中会产生多肽和氨基酸,这些小分子物质易进一步转化为生物胺[5]。因此,对扇贝中多种生物胺含量的研究对水产品质量安全具有重要的研究意义。

海湾扇贝(Argopectensirradiasapp:addword:scallop)因其肉质细嫩,汤味鲜美,为食补精华,是人们喜爱的海味佳肴,现已成为我国重要的经济品种之一。其富含蛋白质、17种氨基酸与锌等多种人体必需的多种维生素和微量元素[6]。目前对贝类产品的加工和养殖等研究较多,但贝类的保鲜[7]少有研究,本文采用HPLC-柱前衍生-FLD[8]检测技术,分离了酪胺、腐胺、尸胺、组胺、色胺、亚精胺和精胺7种生物胺,建立起扇贝生物胺的柱前衍生高效液相色谱分离方法,分析了不同贮藏温度下扇贝体内7种生物胺含量的变化,阐明贮藏温度对生物胺生成量的影响,以监控扇贝贮藏过程中生物胺的种类和含量变化,为提高其贮藏质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

色胺(tryptamine,Tryp)、酪胺(tyramine,Tyr)、组胺(histamine,His)、腐胺(putrescine,Put)、尸胺(cadaverine,Cad)、亚精胺(spermidine,Spd)、精胺(spermine,Spm)1,6-二氨基己烷(1,6-Diaminohexane,简称IS)标准品 均购自Sigma公司;丹磺酰氯(Dns-Cl) 购自上海源叶生物科技有限公司;乙腈、甲醇、丙酮(色谱纯)、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、乙酸铵、碳酸氢钠(NaHCO3)和氨水 均为国产分析纯;水为超纯水;无水乙醇,氯乙酸,生理盐水;蜂胶溶液 食用级,购于河北农业大学科技市场;茶多酚、壳聚糖 食品级,购于青岛恒瑞泰贸易有限公司。

高效液相色谱仪 美国Agilent公司;精密分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;PHS-3C酸度计 上海精密科学仪器有限公司;3K30冷冻离心机 德国Sigma公司;KQ5200E超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司;MM-2微量漩涡振荡器 江苏省沈高康健生化器具厂;DK-8D数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂;冰柜 海尔集团;YLD-6000生化培养箱 江苏定坛市宏华仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 用生理盐水冲洗鲜活带壳扇贝,室温条件下开壳摘取贝柱,再用生理盐水清洗贝柱。将清洗好的贝柱按实验组和对照组进行分类。其中,实验组样品在室温条件下置于由保鲜效果较好且可食用0.2%茶多酚、0.3%蜂胶溶液、1.5%羧甲基壳聚糖配置而成的复合生物保鲜剂溶液中浸泡10min,取出快速沥干后,立即分装于3个无菌保鲜袋中(每袋样品),分别置于常用低温贮藏的冰温、微冻及冻藏温度(0、-5、-20℃)的冰柜中贮藏。对照组样品则在同样处理条件下,使用生理盐水进行浸渍处理。其中,0℃贮藏的样品隔天定时取样测定,-5和-20℃贮藏的样品每天定时取样测定,每组样品平行测定3次。

1.2.2 生物胺的测定 取5g混合均匀肉样放入离心管,加入0.6mol/L高氯酸15mL与100μL 1000ppm的内标,匀浆后4℃ 10000r/min离心15min,取上清液;重复操作1次,合并2次上清液,用2mol/L氢氧化钠溶液调pH至9.5,定容至25mL棕色容量瓶中。取1mL样液,依次加入200μL饱和碳酸氢钠溶液和10g/L丹磺酰氯衍生剂500mL,于45℃避光反应55min。反应结束后加入200μL浓氨水,静置30min,再置于60℃水浴15min除丙酮,用乙腈定容至10mL,混合均匀,样液经过0.45μm滤膜过滤,滤液直接测定或于-20℃贮存。

检测条件:色谱柱:C18(4.60mm×250mm,5μm Catalog No:U35D5.S/N:9A7U73.);流动相:0.1%冰乙酸水溶液和乙腈;柱温:30℃;流速:1.0mL/min;进样量:10μL;检测波长245nm。

在相同条件下测定色胺、酪胺、组胺、腐胺、尸胺、亚精胺、精胺等7种单标及混合标准液的种类和浓度,绘制标准曲线,通过比较样品和标准品的保留时间与峰面积计算各生物胺的含量。

1.2.3 数据处理 利用SPSS 17.0软件对不同贮藏条件下扇贝生物胺的含量进行统计分析,当p<0.01时为极显著差异,0.010.05时差异不显著。

2 结果与分析

2.1 标准品的色谱图

生物胺混合标准品的HPLC图谱如图1所示。在本实验的色谱条件下,7种生物胺在20min内均得到有效分离,且色谱图峰型尖锐、峰型对称、未干扰峰与拖尾现象。

图1 生物胺标准品的HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of biogenic amines standard substance注:1内标;2色胺;3腐胺;4尸胺; 5组胺;6酪胺;7亚精胺;8精胺。

2.2 线性实验

选取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/mL的混合标准工作液按1.2.2的方法进行衍生和测定,其线性关系见表1。从表1的线性关系可以看出,7种生物胺在0.5～20mg/L范围内表现了良好的线性关系,相关系数均≥0.999,可以满足定量要求。

表1 生物胺线性实验结果Table 1 Linear experimental results of biogenic amine

2.3 精密度实验

表3 扇贝生物胺回收率结果Table 3 Recovery results of biogenic amine in scallops

精密度实验如表2所示,通过对10mg/L的生物胺标准品连续进样6次,利用内标校正后,各生物胺的相对标准偏差均小于2.40%,说明仪器精密度良好。

表2 精密度实验结果Table 2 The experimental results of Precision

2.4 回收率实验

向3个样品中添加不同浓度(0.5,2.0,10mg/L)的生物胺混合标准液及内标,平行测定6次,加标回收结果如表3所示。从表3可以看出,7种生物胺在不同的3个加标水平(n=6)上,扇贝生物胺的平均回收率达到90.37%以上,RSD在7.69%以下,充分说明了该法对扇贝的生物胺回收率良好。

2.5 不同温度下扇贝生物胺含量的变化

扇贝在0、-5、-20℃贮藏过程中,对照组和实验组样品中生物胺含量的变化如表4所示。

2.5.1 温度对生物胺的影响 对照组中,温度越低,生物胺产生速度越慢,并且随着贮藏时间的延长,由于0℃和-5℃下扇贝柱后期腐败速度加快,产生的生物胺越多。从-20℃到0℃,Tyr、His、Try及Put的含量低且变化幅度小,Masashi[9]认为生物胺产生菌有嗜冷菌和嗜温菌两大类,鱼体在不同温度时的菌相不同,不仅高温时产生生物胺,低温时也能产生生物胺,只不过低温时菌体代谢缓慢,胺的产量很少,可见扇贝柱中多种生物胺的产生速度可以在低温下得到控制;随着温度的升高及贮藏时间的延长,Spm、Spd及Cad的含量变化差异显著(p<0.05),其中Spd在0℃下呈增长趋势且含量较高,而在-5和-20℃含量一直很低,而Spm变化趋势与之相反,这可能与微生物对不同温度的嗜好和代谢差异有关;而Cad含量在0、-5和-20℃下总体保持上升趋势,并在第3～4d开始上升,第5～6d大幅增长,并且随着温度的升高Cad含量大幅上升,在贮藏末期Cad含量分别为81.63、53.30、32.93,0和-5℃ Cad的末期含量超过FDA规定的最高限量50mg/kg,可见低温可以控制Cad含量,这与扇贝在贮藏过程的后期腐败速度加快有关。赵庆喜等[10]研究了鱿鱼中生物胺在贮藏过程中的变化,发现随着贮藏温度的升高Cad的含量增长越快,可以作为鱿鱼鲜度变化的参考指标;赵中辉[11]研究了中国对虾、中华绒螯蟹、杂色蛤在0和20℃下生物胺的变化,Cad含量变化均显著。因而低温能够控制扇贝多种生物胺的产量,并且Spm、Spd和Cad的变化趋势可作为扇贝在贮藏过程中的质量参考指标。

2.5.2 复合生物保鲜剂结合低温贮藏对扇贝生物胺含量的影响 在0、-5和-20℃条件下相同贮藏时间实验组Tyr、His、Try及Put生物胺含量较对照组基本上均有所降低,以His为例,0、-5和-20℃贮藏第8d时对照组与实验组His含量分别为2.580mg/kg与0.187mg/kg、1.126mg/kg与0mg/kg、无检出,对于危害最大的His,鸿巢章二[12]认为,组氨酸是组胺产生的前体物质,而组氨酸以咪唑二肽的形式存在于水产品中,游离的组氨酸与咪唑二肽是支撑水产品活泼运动时的缓冲物质。对于游泳能力强的鱼类,其肌肉中组氨酸与咪唑二肽含量较多,所以这些水产品腐败时可能会产生大量的组胺。然而,在贝类、虾、蟹类的运动相对较弱,其肌肉中几乎没有肌肽、鹅肌肽和鲸肌肽等咪唑二肽检出,所以组胺产生的可能性就不大。而在0、-5和-20℃条件下实验组Cad、Spm或Spd总体上均低于对照组的含量,在贮藏末期,以Cad含量为例,0、-5和-20℃对照组与实验组分别为81.63mg/kg与50.72mg/kg、53.30mg/kg与34.71mg/kg、32.93mg/kg与19.54mg/kg,可见复合生物保鲜剂结合低温贮藏在能够明显控制扇贝中生物胺的产生,对扇贝的质量有良好的改善作用。 陈舜胜[13]用溶菌酶浸泡扇贝柱并加冰保鲜,5℃条件下冷藏7d,TVB-N值为18mg/100g,对照组是30mg/100g;第6d菌落总数分别是8.1×104护和1.1×106,相差13.6倍;此外吴雪丽[14]以蜂胶溶液作为生物保鲜剂在0℃贮藏扇贝,有效地抑制挥发性盐基氮的产生以及微生物的生长,减缓腐败变质,延长货架期。

表4 扇贝生物胺含量变化Table 4 The change of biogenic amines amount in scallops

3 结论

本文利用丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱法测定了扇贝中生物胺的种类和含量,7种生物胺在20min内完成分析,具有快速简便,准确性和重复性好等特点,适合水产品中生物胺含量的批量快速检测分析。同时,还探讨了温度及复合生物保鲜剂对扇贝生物胺含量变化的影响。结果表明,贮藏温度对扇贝中Cad、Spd、Spm含量的变化差异均显著(p<0.05),温度越高,生物胺产生速度越快。Cad、Spm、Spd可以作为扇贝贮藏过程中质量变化的参考指标;并且低温贮藏结合复合生物保鲜剂对扇贝柱中Cad、Spd、Spm的产生有显著的抑制作用,对扇贝贮藏有较好的保鲜作用。

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Effect of complex biological preservatives combined with freezing-point storage on the content of seven kinds of biogenic amines

HAN Dong-jiao,WU Xue-li,LI Jing

(College of Food Science and Technology,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China)

In this paper,pre-column derivatization HPLC was used to seperate seven kinds of biogenic amines including tyramine(Tyr),putrescine(Put),cadaverine(Cad),histamine(His),tryptamine(Try),spermine(Spd)and spermidine(Spm)in bay scallop in 20min. And the change of biogenic amines amount in scallops was determined and analyzed duiring the storage at 0,-5 and -20℃. The results showed that the effect of storage temperature on the content of Spd,Spm and Cad in the scallop was significant(p<0.05),and the higher the temperature was,the faster the three kinds of biogenic amines were produced,so Cad,Spm and Spd can be the reference indexes for the change of quality of scallops during storage. And freezing-point storage combined with complex biological preservatives had significant inhibitory effect on the producing of Cad,Spd and Spm in the scallop column. Therefore,freezing-point storage combined with complex biological preservatives was the effective measure of controlling the quality of scallops.

scallops;biogenic amines;complex biological preservatives;HPLC

2014-08-11

韩冬娇(1988-),女,硕士,研究方向：水产品加工与贮藏。

国家海洋局海洋公益性行业科研专项经费(201205031)。

TS254.4

A

1002-0306(2015)11-0301-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.052