亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜形成的抑制作用

渠宏雁,李学鹏,*,仪淑敏,白凤翎,张德福,李 春,李婷婷,励建荣,*

(1.渤海大学 食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室,辽宁锦州 121013;2.渤海大学 数理学院,辽宁锦州 121013;3.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600)

亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜形成的抑制作用

渠宏雁1,李学鹏1,*,仪淑敏1,白凤翎1,张德福1,李 春2,李婷婷3,励建荣1,*

(1.渤海大学 食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室,辽宁锦州 121013;2.渤海大学 数理学院,辽宁锦州 121013;3.大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600)

本文以金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为研究对象,采用微孔板检测法,分别以OD630值与生物被膜清除率反映两种菌的生物被膜生成量及不同培养时间添加不同浓度亚硝酸钠对两种菌形成生物被膜的抑制效果,并通过细胞表面反应和细胞间聚集实验初步研究其抑制机理。结果表明:亚硝酸钠对两种致病菌生物被膜的形成均有一定的抑制作用,600 mg/L、培养48 h对金黄色葡萄球菌生物被膜清除率达37.31%,抑制效果最佳;而对副溶血性弧菌而言,添加200 mg/L亚硝酸钠培养12 h时清除率达36.67%,效果最佳。由细胞表面反应与细胞间聚集实验结果表明,亚硝酸钠能有效抑制两种菌的表面粘附和菌体聚集,其主要通过影响细胞聚合与表面粘附,从而抑制金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜的形成与生长。

生物被膜,金黄色葡萄球菌,副溶血性弧菌,亚硝酸钠,抑制作用

细菌生物被膜(Bacterial biofilm,BF)是指附着于接触物表面、被蛋白和多糖等细菌胞外大分子包裹的多细胞群体结构,是许多微生物在恶劣环境中采取的生存策略[1-5]。越来越多的研究表明,细菌生物被膜粘附在食品加工设备上难以清除,是导致食品加工环境中难以实现完全无菌化加工,引发食品安全隐患的主要原因[6-9]。

表1 麦氏比浊管的配比

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)和副溶血性弧菌(VibrioParahaemolyticus,VP)是食品中常见的食源性致病微生物,威胁人类健康。金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌,具有强大的生物被膜形成能力[10-12]。副溶血性弧菌属革兰氏阴性嗜盐海洋细菌[13],具有形成生物被膜的能力[7]。

近年来,国内外已有诸多学者致力于抑制生物被膜形成的相关研究。Chauhan等[14]发现EDTA和庆大霉素混合物抑制了与导管有关的多种致病菌生物被膜的形成。马有智等[15]探究了铜离子对嗜水气单胞菌生物被膜形成的影响,发现铜离子能使嗜水气单胞菌生物被膜的形成与毒力效果减弱。亚硝酸钠在肉类制品加工中用作护色剂和防腐剂,在腌腊肉制品、酱卤肉制品、西式火腿类、油炸肉类等多种肉制品中最大使用量为0.15 g/kg[16],在此范围内使用不存在食品安全问题。目前,亚硝酸钠对致病菌生物被膜形成的影响未见报道。本文采用微孔板法研究不同浓度亚硝酸钠对不同培养时间的金黄色葡萄球菌与副溶血性弧菌生物被膜形成的影响。通过试管法与置片法研究亚硝酸钠对两种菌细胞间相互作用与细胞表面反应的影响,旨在探讨亚硝酸钠对生物被膜的抑制机制,为致病菌生物被膜的控制提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC6538),副溶血性弧菌(VibrioParahaemolyticus,ATCC17802) 中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)；胰蛋白胨大豆肉汤(Trypticase Soy Broth,TSB),3%氯化钠碱性蛋白胨水(3% Sodium Chloride Alkaline Peptone Water,APW) 北京奥博星生物技术有限责任公司；结晶紫、冰醋酸、亚硝酸钠、甲醇等所用试剂均为分析纯。

BCM-1000A型生物洁净工作台 苏州净化过滤设备有限公司;SC-303型电子管电热恒温培养箱 浙江省嘉兴县新腾电器厂;SLJ-I型中型电动离心机 沈阳市红星五金电器厂;DG5031型酶标仪 华东电子集团医疗装备有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 增菌培养 将活化的金黄色葡萄球菌菌种接种于TSB液体培养基中,37 ℃孵育24 h;副溶血性弧菌菌种接种于APW液体培养基中,28 ℃培养24 h;低温高速离心(10000 r/min,10 min,4 ℃)。弃去上清液,收集菌体,根据麦氏比浊用无菌生理盐水配制菌液浓度为6×108/mL的溶液保存于4 ℃冰箱中,备用,麦氏比浊管[17]是McFarland发明的一种用于微生物比浊的标准浊度管,具体配比见表1。

1.2.2 生物被膜的制备及抑制作用实验 方法参照Chang等[18]并略有修改。在灭菌后的96孔板加入(1)150 μL TSB液体培养基和50 μL金黄色葡萄球菌菌液,混匀,于37 ℃孵育24 h后更换新鲜无菌PBS培养基,或加入(2)150 μL APW液体培养基和50 μL副溶血性弧菌菌液,混匀,于28 ℃孵育24 h后更换新鲜无菌APW培养基;随后分别在12、24、48、72、96和120 h时加入低浓度亚硝酸钠溶液为实验组。董庆利[19]报道了0～500 mg/L亚硝酸盐能显著影响生孢梭菌超微结构,导致其细胞壁破裂、变薄或消失,胞浆内容物溶解或流失等。因此,选择50、100、200、400和600 mg/L的亚硝酸钠溶液作为实验组,对照组不添加亚硝酸钠溶液,每组4个平行,2 h后取出96孔平板,酶标仪法测定OD630值。

1.2.3 生物被膜的形成与测定 将菌悬液与培养基按1∶3体积混匀后,每组4个平行,以无菌培养基为空白对照。每次取出测定时,先弃去培养液,用生理盐水250 μL/孔清洗2 次,60 ℃干燥固定30 min,随后用0.1%结晶紫溶液200 μL/孔染色5 min后弃去染液,用生理盐水250 μL/孔清洗3 次,60 ℃干燥后,于200 μL/孔的33%冰醋酸溶解5 min,采用酶标仪法测定OD630值[20]。

1.2.4 清除率的计算 采用清除率可以直观反映抑制剂对生物被膜的清除效果,其计算公式如下:

Q-细菌生物被膜清除率(%);A1:对照组菌液OD630值;A2:处理组菌液OD630值。

1.2.5 细胞表面相互作用实验 将培养好的细菌菌液按1∶100比例分别接种于含有600mg/L亚硝酸钠的液体培养液中,随后加入培养皿,以不含亚硝酸钠的菌液做对照,放入载玻片作为生物被膜载体。在最适温度条件下孵育10h后取出,经生理盐水漂洗除去浮游菌,置于无菌培养皿中,以适量甲醇固定15min,再加入2%结晶紫溶液染色5min,用少量自来水冲洗,30 ℃干燥30min后,33%冰醋酸脱色5min,烘干后置于光学显微镜下观察,并作拍照记录[14]。

1.2.6 聚集实验 在试管中分别加入含有600mg/L亚硝酸钠的液体培养液5mL,并以不含亚硝酸钠的培养液为对照,每试管中分别接种3环菌液,最适温度下孵育48h,观察并记录实验结果[21]。

2 结果与分析

2.1 不同浓度亚硝酸钠对两种菌的抑制作用

2.2.1 亚硝酸钠对细菌生长的影响 由图1可知,4～48h,随着培养时间的延长,对照组和各实验组OD630值均逐渐升高,说明两种致病菌的生物被膜持续生长;72h后,OD630值变化趋于平缓,说明此时生物被膜生长缓慢;培养至120h时,对照组OD630值均略有下降,与对照组相较,金黄组添加低浓度亚硝酸钠(50mg/L和100mg/L)其OD值96h就开始下降,而副溶组OD值则在120h开始下降。同时随着亚硝酸钠浓度增加,各实验组OD630值低于同一时间对照组OD值。比较图1a和图1b,各时间段金黄色葡萄球菌OD值均高于副溶组,表明金黄色葡萄球菌具有更强大的生物被膜形成能力。此外,与金黄组相较,副溶组在培养4～24hOD值变化趋势平缓,说明此时副溶血性弧菌生物被膜形成缓慢。因此,亚硝酸钠能在一定程度上抑制金黄色葡萄球菌(图1a)和副溶血性弧菌(图1b)生物被膜的生长,且随着浓度的升高抑制作用增强。

图1 不同浓度的亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌的生物被膜形成的影响Fig.1 Growth curve of S. aureus and V. Parahaemolyticus bacterial biofilm under different concentration of sodium nitrite

2.2 亚硝酸钠对两种菌不同培养时间的抑制作用

由图2a至图2f可知:与对照组相比,随着亚硝酸钠浓度的增加,SA实验组和VP实验组的OD630值均呈下降趋势,即五个浓度对两种致病菌的生物被膜均有清除效果。可见,五个浓度的亚硝酸钠对不同培养时间的两种菌生物被膜均表现出明显的抑制效果,且抑制作用具有浓度依赖性,随着浓度增加清除效果愈益显著,细菌不同培养时间中添加亚硝酸钠的抑制效果为浓度依赖型,但与SA实验组不同,VP实验组在亚硝酸钠浓度为200 mg/L时已对其生物被膜的生长起到良好的抑制效果,继续增大添加量其OD值变化未超出误差线范围,说明继续增大亚硝酸钠添加量对抑制VP生物被膜的形成无意义。因此,亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜生长的最佳抑制浓度分别为600 mg/L和200 mg/L。为进一步探究亚硝酸钠添加时间及添加浓度对金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜的影响,本文比较了不同生长时间添加不同浓度的亚硝酸钠对两种细菌生物被膜的清除率。由图2g和2h所知,培养初期,亚硝酸钠对SA组生物被膜的清除率呈上升趋势,培养时间达48 h时清除率最高,48 h后的清除率呈下降趋势。但随着亚硝酸钠浓度的提高,其对SA的清除率始终呈现明显的上升趋势。可见,48 h添加600 mg/L亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用最显著。对于VP组而言,培养12 h添加亚硝酸钠对其生物被膜呈明显的抑制效果,清除率最大,而在随后的培养时间内添加亚硝酸钠,其清除率均明显小于12 h实验组;当亚硝酸钠添加量达200 mg/L时,VP组生物被膜清除率已明显高于添加量为50 和100 mg/L时,继续增大添加量,清除率曲线趋于平缓,由此可知,12 h添加200 mg/L亚硝酸钠时,副溶血性弧菌生物被膜清除率为36.67%,抑制作用达最大。

已有报道表明,细菌在接触表面的粘附是细菌形成生物被膜的第一步,这种粘附作用主要是细菌表面特定的粘附素蛋白识别接触表面受体的结果,因此具有选择性和特异性[22]。由于微生物粘附在接触表面并形成生物被膜过程很快,因此几乎不可能完全控制生物被膜的形成[23],通过在培养基中加入抑菌物质以阻止微生物在其表面上的粘附可作为一种控制生物被膜形成的途径。目前,已有对材料表面进行改性来降低细菌在材料表面粘附,或通过涂覆抗生素、添加银离子等抗菌素的方法在材料表面引入杀菌物质以抑制细菌的生长及生物被膜形成的研究[24],还有头孢曲松对表皮葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用的研究[25],但亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜抑制作用的相关研究却一直未见报道,本文为抑制细菌生物被膜的形成提供一个新的思路。Chang等[18]报道了EDTA对单增李斯特菌生物被膜的影响,指出EDTA通过影响细菌的初期粘附抑制了李斯特菌生物被膜的形成,这与本文亚硝酸钠对副溶血性弧菌生物被膜抑制的成因一致。然而,亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用却主要表现在中期,细菌生物被膜复杂的胞外基质及其本身的三维立体结构是许多生物制剂进入生物被膜内部的障碍,亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌未能在生物被膜形成初期就表现出良好的抑制效果可能与其生物被膜的结构和基质有关[26]。

图2 亚硝酸钠对两种菌不同培养时间细菌生物被膜的影响Fig.2 Effects of different concentrations of sodium nitrite on bacterial biofilm at different growth times注:a:12 h,b:24 h,c:48 h,d:72 h,e:96 h,f:120 h,g:不同浓度亚硝酸钠对SA不同培养时间的生物被膜清除率影响,h:不同浓度亚硝酸钠对VP不同培养时间的生物被膜清除率影响。

2.3 细胞表面反应实验

图3为两种菌在显微镜下的细胞表面反应形态,对照组(图3a和图3c)为不含亚硝酸钠的载玻片在镜下的形态,可以看出细胞已开始明显聚合,并还有进一步聚合的趋势,而实验组(图3b和图3d)的细胞聚合程度大大降低,松散的分布在载玻片上。可见,亚硝酸钠可抑制金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的细胞表面反应,进而影响其粘附性。这可能是因为亚硝酸钠影响了金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的细胞疏水性[27]。

图3 亚硝酸钠对两种菌细胞表面反应的影响(1000×)Fig.3 Cell-surface interaction assay注:a:SA对照组,b:含600 mg/L亚硝酸钠的SA实验组,c:VP对照组,d:含200 mg/L亚硝酸钠的VP实验组,图4同。

2.4 聚集实验结果

图4中可清晰看出对照管(图4a和图4c)液体澄清较透明,试管底部有明显沉淀,而含有600 mg/L亚硝酸钠的实验管(图4b和图4d)中有悬浮状态的固体颗粒,试管底部也有沉淀,但较为分散。此现象证明亚硝酸钠可抑制细胞间的聚合反应。其中VP实验组悬浮的固体颗粒明显多于SA实验组,底部沉淀也更为分散。可见,200 mg/L亚硝酸钠对副溶血性弧菌聚合性的抑制作用优于600 mg/L亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌聚合性的抑制作用。

另外,细胞表面反应与细胞间反应的聚合实验结果显示,亚硝酸钠能抑制细胞表面和细胞间的反应,且抑制作用较明显,可以看出聚集的细胞由于亚硝酸钠的加入被打散,分布在载玻片或试管中,影响了细菌的疏水性和聚合度。实验中观察到亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的抑制作用结果并不完全一致,这可能是两种菌自身结构和特性的不同造成的。

图4 亚硝酸钠对两种菌细胞聚合效果的影响Fig.4 The result of aggregation assay

3 结论

本实验探究了亚硝酸钠对两种典型的致病性细菌——金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜的影响,发现亚硝酸钠对金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌生物被膜的生长具有抑制作用。

添加600 mg/L亚硝酸钠、培养48 h对金黄色葡萄球菌生物被膜清除率达37.31%,抑制效果最佳;而对副溶血性弧菌而言,其在200 mg/L亚硝酸钠下培养12 h清除率达36.67%,效果最佳。

亚硝酸钠对生物被膜的抑制作用可能是由于亚硝酸钠抑制细菌粘附、聚合、细胞表面相互作用的综合作用造成的。

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Inhibiting effect of Sodium nitrite on biofilm formation ofStaphylococcusaureusandVibrioParahaemolyticus

QU Hong-yan1,LI Xue-peng1,*,YI Shu-min1,BAI Feng-ling1,ZHANG De-fu1,LI Chun2,LI Ting-ting3,LI Jian-rong1,*

(1.College of Food Science & Engineering,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China;2.College of Mathematics and Physics,Bohai University,Jinzhou 121013,China;3.College of Life Science,Dalian Nationality of University,Dalian 116600,China)

The effect of sodium nitriteinvitroon adhesion,formation and eradication ofStaphylococcusaureus(SA)andVibrioParahaemolyticus(VP)biofilm was studied by using microtiter plate assay in this paper. More information about the inhibition mechanism was gotten by cell-surface interaction assay and cells aggregation assay. The results indicated that the concentration-dependent inhibition effect ofS.aureusbiofilm was predominant with 600 mg/L sodium nitrite added after 48 h. The bacterial biofilm clearance at this time was 37.31%. However,adding 200 mg/L of sodium nitrite after 12 h of biofilm formation had the strongestV.Parahaemolyticusbiofilm suppression effects with the clearance 36.67%. It was suggested by cell-to-surface interactions and cell-to-cell aggregation interaction to inhibition effect of sodium nitrite on adhesion and bacterial aggregation ofS.aureusandV.Parahaemolyticus. In conclusion,sodium nitrite can restrain the formation and growth ofS.aureusandV.parahaemolyticusbiofilm,by influence cells aggregation and cell-surface adhesion.

biofilm;Staphylococcusaureus;VibrioParahaemolyticus; sodium nitrite;inhibitory activity

2015-01-28

渠宏雁(1985-)，女，硕士，研究方向：水产品储藏加工，E-mail：yueyufei@126.com。

*通讯作者:李学鹏(1982- )，男，博士，副教授，主要研究方向：水产品贮藏加工，E-mail：xuepengli8234@163.com。 励建荣(1964- )，男，教授，博士，主要研究方向：水产品贮藏加工与食品安全，E-mail：lijr6491@163.com。

国家自然科学基金(31471639)；“十二五”国家科技支撑计划课题(2012BAD29B06)；辽宁省教育厅创新团队项目(LT2014024)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0178-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.028