竹叶椒乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其机理研究

张丙云,苏 丹,郭 涛,章聚宝,潭素北,魏黎阳

(兰州理工大学生命科学院,甘肃兰州 730050)

竹叶椒乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其机理研究

张丙云,苏 丹,郭 涛*,章聚宝,潭素北,魏黎阳

(兰州理工大学生命科学院,甘肃兰州 730050)

目的:研究竹叶椒乙醇提取物对α-糖苷酶的抑制作用。方法:本实验采用体外抑制模型评价竹叶椒乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶(酵母菌来源、小鼠小肠来源)和α-淀粉酶的抑制活性。并采用Lineweaver-Burk双倒数法研究α-葡萄糖苷酶的动力学性质。结果:竹叶椒乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶(酵母菌来源)的半数抑制浓度(IC50)为(0.660±0.145) mg·mL-1,对小鼠小肠内α-葡萄糖苷酶半数抑制浓度(1.944±0.078) mg·mL-1,α-淀粉酶的半数抑制浓度为(1.185±0.132) mg·mL-1。动力学研究表明,竹叶椒乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用为典型非竞争性抑制。结论:竹叶椒乙醇提取物对α-糖苷酶活性的抑制效果显著,具有很好的开发利用价值。

竹叶椒,α-葡萄糖苷酶,α-淀粉酶,非竞争抑制

糖尿病是全球范围内严重影响人类健康的疾病,且发病率逐年上升[1]。发病原因是由于胰岛素分泌不足、胰岛素作用减弱或胰岛素抵抗所致引发的内分泌代谢紊乱性疾病[2]。根据发病机制不同,分为Ⅰ型糖尿病(胰岛素依赖型)和Ⅱ型糖尿病(非胰岛素依赖型),其中Ⅱ型糖尿病患者占有相当大的比重[3]。糖尿病最主要的代谢异常是餐后高血糖,这种现象是致使Ⅱ型糖尿病更为严重的原因之一[4]。正常人饮食之后,淀粉等碳水化合物在体内首先被α-淀粉酶分解为麦芽糖、麦芽三糖、α-糊精等,再与蔗糖共同被α-糖苷酶分解成葡萄糖、果糖、半乳糖,被小肠吸收[5]。其中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是引起餐后血糖升高的两种主要的酶。由于Ⅱ型糖尿病患者代谢障碍,致使餐后血糖异常升高,会对患者身体机能产生重要伤害。因此,寻找有效的α-糖苷酶抑制剂,抑制餐后血糖升高,是治疗Ⅱ型糖尿病的一个主要手段。

近年来,从天然产物和食品原料中发现α-糖苷酶抑制剂成为当前研究的热点之一[6-8]。许多天然产物的成分对α-糖苷酶具有抑制作用,例如人参皂苷对α-葡萄糖苷酶抑制作用在一定程度上趋近于阿卡波糖[9],番石榴叶黄酮与多糖混合物对蔗糖酶,麦芽糖酶以及α-淀粉酶的抑制率分别为75.8%,53.5%和60.1%[10],也有报道,南瓜作为一种传统的降血糖食物,具有良好的降血糖活性[11]。

竹叶椒(ZanthoxylumarmatumDC.)是一种常见的花椒属药食两用植物,在我国的大部分地方有分布,部分地方有栽培。其在我国部分地方也用作花椒的代用品。具有镇痛、抗炎、解痉、杀虫等药理活性。本研究拟开展竹叶椒乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究,并探讨其作用机理,以期为我国丰富的竹叶椒资源进一步开发利用提供实验依据。

表1 竹叶椒乙醇提物和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用IC50值比较

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

竹叶椒药材根粉末、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,G0660-750UN,来源于酿酒酵母,10 U·mL-1)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG,N1377-1G) 美国Sigma公司;α-淀粉酶(α-amylase,A3403-500KU,来源于地衣芽孢杆菌,1 U·mL-1);磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、二甲亚砜(DMSO) 天津市大茂化学试剂厂;所用的所有化学试剂均为分析纯;实验小鼠 清洁级昆明小鼠,(合格证号:医动字第14.005),兰州大学动物实验中心。

AB104-N电子分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;UV-9200 紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司;HH-2型数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器;KQ-250DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;TDL-5A台式离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 竹叶椒乙醇提取物的制备 将竹叶椒的干燥根粉碎,过40目筛。称取100 g竹叶椒根粉末,使用1000 mL 80%乙醇回流提取2次,合并两次滤液,减压浓缩至干,获得乙醇提取物浸膏10.2 g,于4 ℃储藏备用。

1.2.2 竹叶椒提取物对酿酒酵母来源α-葡萄糖苷酶抑制率的测定 α-葡萄糖苷酶溶液15 μL(10 U·mL-1)与30 μL竹叶椒乙醇提取物溶液混合均匀后(浓度为0.25～5 mg·mL-1),加入1860 μL磷酸缓冲液(pH6.8),将混合液于37 ℃下孵化20 min,加入PNPG(30 μL,10 mmol·L-1)使其在37 ℃下孵化30 min,添加1980 μL碳酸钠(1 mol·L-1)终止反应,立即添加蒸馏水稀释到10 mL,在分光光度计下测量吸光值。空白组由30 μL磷酸缓冲液代替样品溶液。每组实验重复3次[12]。抑制率计算式如下:

式中:A空白为不加抑制剂反应后的吸光值,A样品是加入样品后酶反应的吸光值。

1.2.3 竹叶椒提取物对α-淀粉酶抑制率的测定 40μL竹叶椒乙醇提取物溶液(浓度为0.25～5mg·mL-1)与400μL淀粉溶液(0.25%)混合均匀,25 ℃孵化10min后,将200μL淀粉酶(1U·mL-1)溶液加入其中。于37 ℃孵育5min后取出加入DNS溶液(1mL)。沸水浴5min后,立即添加蒸馏水稀释至10mL,在分光光度计540nm处测量吸光值。每组实验重复3次[13]。抑制率计算式如下:

式中:A空白为不加抑制剂反应后的吸光值,A样品是加入样品后酶反应的吸光值。

1.2.4 小鼠小肠α-葡萄糖苷酶的制备与测定 采用颈椎脱位的方法处死小鼠,获得小鼠小肠。分别采用0.9%的冷冻NaCl和10 mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH7.0)清洗肠道脂肪组织并纵向切开洗净内容物,按体积比为1∶3加入4 ℃预冷的磷酸钠缓冲液(pH7.0)。混合物研磨后于4 ℃下8000 r·mim-1离心20 min,吸取上清液后分装,-20 ℃贮存以备用。测定方法同1.2.2,竹叶椒乙醇提取物溶液浓度为1～10 mg·mL-1[14]。

1.2.5 酶抑制动力学 将10 mmol·L-1PNPG按比例稀释,使其终浓度分别为0.25、0.5、1、2、10 mmol·L-1。30 μL稀释后的PNPG加入试管中,并加入1260 μL磷酸缓冲液(pH7.0),37 ℃恒温静置30 min。加入15 μL α-糖苷酶溶液,30 μL磷酸缓冲液(pH7.0)后,立即在波长410 nm下测量其吸光值,根据米氏方程进行数据处理即可得到相应的最大速度(Vmax)和米氏常数(Km)。依次加入1、2.5 mg·mL-1乙醇提取物溶液30 μL,重复实验。根据Lineweaver-Burk 双倒数作图法研究抑制机理。每组实验重复3 次[15]。

1.2.6 数据处理 以SPSS 20.0 统计软件包进行统计分析。所有计量数据均以x±s表示,用方差分析及LSD法比较各实验组的IC50值。

2 结果与讨论

2.1 竹叶椒乙醇提取物对酿酒酵母来源α-葡萄糖苷酶的抑制作用

如图1所示,竹叶椒乙醇提取物对α-糖苷酶有抑制作用。在实验的0.25～5 mg·mL-1范围内,随着乙醇提取物浓度的升高,抑制率升高,醇提物的最高抑制率为72.4%。IC50为(0.660±0.145)mg·mL-1(表1),阳性对照阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶最高抑制率为83%,IC50为(0.810±0.109) mg·mL-1值。与阳性对照组(2.5 mg·mL-1阿卡波糖)比较,竹叶椒乙醇提取物浓度为在0.25 mg·mL-1时两者有显著性差异(p<0.05)。相对于阳性对照,其抑制率较低,抑制效果低于阳性对照;其抑制率为30.45%,也有抑制作用。

图1 竹叶椒乙醇提物对α-葡萄糖苷酶(酿酒酵母)活性的抑制作用Fig.1 The inhibition of α-glycosidase enzymes of ethanol extract from Zanthoxylum armatum DC.注：*：p<0.05,**：p<0.01,与阳性对照浓度为2.5 mg·mL-1阿卡波糖相比；图2、图3同。

2.2 竹叶椒乙醇提取物对小鼠小肠α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由图2可知,在1～10 mg·mL-1范围内,随着竹叶椒醇提物浓度的升高,对糖苷酶抑制率升高。其对小肠内α-葡萄糖苷酶的IC50为(1.944±0.078)mg·mL-1(表1)。与阳性对照组比较,竹叶椒醇提取物在浓度为1、1.25、2、2.5 mg·mL-1时,两者有显著性差异(p<0.05)。只有在5、10 mg·mL-1时,其与阳性对照无显著性差异,抑制率较高。

图2 竹叶椒乙醇提物对小鼠小肠α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.2 The inhibition of rat small intestine α-glycosidase enzymes of ethanol extract from Zanthoxylum armatum DC.

2.3 竹叶椒乙醇提取物对α-淀粉酶的抑制作用

图3显示,乙醇提取物浓度在0.25～2.5 mg·mL-1范围内,随着其浓度升高,对α-淀粉酶抑制率升高,当质量浓度大于2.5 mg·mL-1时,抑制活性不再随浓度增加而增大。当乙醇提取物浓度达到5 mg·mL-1时,醇提物抑制率达到62.94%。由表1可知,对α-淀粉酶的抑制作用的IC50值为(1.185±0.132)mg·mL-1。与阳性对照组比较,竹叶椒醇提取物在0.25、0.5、1 mg·mL-1有显著性差异。竹叶椒醇提取物尤其在0.25 mg·mL-1显著性差异很明显(p<0.01)。

图3 竹叶椒乙醇提物对α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.3 The inhibition of α--amylase enzymes of ethanol extract from Zanthoxylum armatum DC.

2.4 酶动力学研究

选择竹叶椒醇提物0、1、2.5 mg·mL-1三个浓度梯度,PNPG取5 个不同浓度,测定反应速度。根据Lineweave-Burk作图法,以1/[S]为横坐标,1/V为纵坐标,分别绘制3个浓度的抑制作用动力学曲线(图4),通过计算可得到α-葡萄糖糖苷酶的Km 值为1.312 mmol·mL-1。从图中可以看出,反应速度Vmax随着抑制剂浓度的增大而变小,米氏常数Km 保持不变,是典型的非竞争性抑制的特点,说明乙醇提取物作用于酶与底物的结合物,竹叶椒乙醇提取物属于非竞争性抑制。

图4 不同底物浓度下竹叶椒提取物的Linweave-Burk双倒数曲线Fig.4 Lineweaver-Burk plot of extracts to the substrate PNPG at different concentration

3 讨论与结论

本文采用体外模型评价竹叶椒醇提物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。结果显示醇提物对酿酒酵母来源的α-葡萄糖苷酶、小鼠小肠的α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶均有一定的抑制作用。其中对酿酒酵母来源α-糖苷酶抑制活性最强(IC50=(0.660±0.145) mg·mL-1),其IC50小于阳性对照阿卡波糖的(IC50=(0.810±0.109) mg·mL-1),与文献报道的[16]蜂胶乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的(IC50=(0.8260± 0.1754) mg/mL)接近。

在小鼠小肠糖苷酶抑制实验中,由于在小鼠小肠内刷状绒毛上的α-葡萄糖苷酶和在人体内的α-葡萄糖苷酶属于同种类别的酶类[17],可以推测竹叶椒醇提物对人体内的α-葡萄糖苷酶有一定的抑制效果。在所有实验中,乙醇提取物的抑制活性均与浓度呈正相关性,说明其抑制活性在实验浓度范围内具有剂量依赖性。通过抑制动力学研究,发现竹叶椒乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶(啤酒酵母来源)为非竞争性抑制,证明它通过与酶和底物复合物结合而降低酶活性,达到抑制α-葡萄糖苷酶的作用。

本研究证实竹叶椒具有抑制α-糖苷酶的活性。竹叶椒乙醇提取物中含有大量的花椒属植物特征性成分:生物碱和双四氢呋喃木脂素,这两类成分也可能是竹叶椒抑制α-糖苷酶的主要药理活性成分。因此后续有待进行药理活性跟踪分离、鉴定药理活性成分,阐述其抑制α-糖苷酶的的化学物质基础，以期从竹叶椒中开发新型α-糖苷酶抑制剂。

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Study on the inhibitory effect and inhibition mechanism on α-glycosidase of ethanol extract fromZanthoxylumarmatumDC.

ZHANG Bing-yun,SU Dan,GUO Tao*,ZHANG Ju-bao,TAN Su-bei,WEI Li-yang

(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

Objective:To investigate different ethanol extract ofZanthoxylumarmatumDC. on inhibitory activity to a-glucosidase. Method:The inhibitory activity of these ginsenosides for the a-glucosidase and a-amylase were determined byinvitroexperiments. Inhibitory kinetic parameters were determined by Lineweaver-Burk plot. Results:The median inhibitory concentration(IC50)of ethanol extract was(0.660±0.145)mg·mL-1on α-glucosidase,(1.185±0.132)mg·mL-1on α-amylase and(1.944±0.078)mg·mL-1on α-glucosidase from small intestine in mice. Kinetic analysis showed that the inhibitory mechanism ofZanthoxylumarmatumDC. on α-glucosidase was a typical noncompetitive inhibition. Conclusion:Ethanol extract ofZanthoxylumarmatumDC. have remarkable inhibitory effect to α-glucosidase activity.

ZanthoxylumarmatumDC.;α-glucosidase;α-amylase;noncompetitive inhibition

2014-12-24

张丙云(1968-),女,硕士,研究方向:食品保鲜研究,E-mail:494467885@qq.com。

*通讯作者:郭涛(1976-),男,博士,研究方向:中药新药筛选研究,E-mail:gt010010@163.com。

国家自然科学基金(81360476)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)21-0345-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.063