模拟肠道环境下肠道益生菌对三种重金属离子的富集作用的研究

张 何,罗程印,傅 昕

(湖南工程学院化学化工学院,湖南湘潭 411104)

模拟肠道环境下肠道益生菌对三种重金属离子的富集作用的研究

张 何,罗程印,傅 昕

(湖南工程学院化学化工学院,湖南湘潭 411104)

本研究考察了嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌三种肠道益生菌在模拟肠道环境条件下生长情况及对Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性。结果显示:嗜酸乳杆菌对Cr6+有较强的吸附和富集作用,最大吸附率为70%,吸附量为0.0021 mg/g;嗜热链球菌对Cr6+、Cd2+均有较强的吸附和富集作用,最大吸附率分别为50%和62%,吸附量分别为0.0015 mg/g和0.1057 mg/g;双歧杆菌对Cr6+、Cd2+均有较强的吸附和富集作用,最大吸附率分别为66.6%和69.9%,吸附量分别为0.0019 mg/g和0.1298 mg/g;三种肠道益生菌在模拟肠道环境下对Pb2+均无明显吸附作用。

肠道益生菌,肠道环境,重金属离子,富集

随着人类对重金属的开采、冶炼、加工以及工业废水的不当排放,造成大量重金属如铅、汞、镉、铬等进入大气、水、土壤中,造成了严重的环境污染。近年来,食品安全事件也频频发生[1-3]。在对重金属处理的方法中,生物处理技术已被证明比传统的化学沉淀法、离子交换法、活性炭吸附法等更为优越,而生物处理法中目前应用最多的是生物吸附法[4-5]。当前发现的通常可以吸附重金属离子的微生物种类较多[6-9],主要是由细菌[10]、真菌[11]和藻类[12]组成。

益生菌(Probiotics)是一种通过改善宿主肠道微生物平衡而发挥作用的活性微生物,具有广泛的生理功效,能够为人体营养和健康提供良好的保障[13-19]。由于益生菌对人体有着极其重要的保健功能,已被广泛应用于食品、医药保健等领域,如活性益生菌乳饮料、酸奶等。然而,肠道益生菌对于肠道中重金属的吸附及转化性能研究还未见报道。

环境中污染物对人体的生物有效性胃肠体外实验始于营养学研究食物中铁元素对人体的生物有效性[20]。MRS培养基是一种用于模拟体外胃肠道环境的常用细菌培养基[21-22],而对于重金属离子的体外肠道模拟分析,由于pH对其溶解析出有较大的影响,肠道模拟方法中的pH一般控制在5.5～7.5左右[23]。本研究考察了三种肠道益生菌(双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌)在模拟肠道环境条件下对重金属(铬、镉、铅)的吸附性能,探索其减弱重金属危害的有益性,可更加全面的认识肠道益生菌的健康维护作用,能够为益生菌在食品中的进一步应用提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三种肠道益生菌(嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus),嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus),双歧杆菌(Bifidobacterium) 北京豫鼎鑫捷科技有限公司;酵母膏、蛋白胨 青岛高科园海博生物技术有限公司;吐温80、乙酸钠、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、牛肉膏、硫酸镁、硫酸锰、葡萄糖、六次甲基四胺、重铬酸钾、二甲酚橙、孔雀绿、邻苯二甲酸氢钾、硝酸镉、硝酸铅 生工生物工程上海(股份)有限公司;二苯碳酰二肼 上海科兴商贸有限公司;所用试剂均为分析纯,使用前未进一步纯化,实验用水为电阻率大于18 MΩ·cm 的超纯水。

电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器公司;TDL-40B型离心机、DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海基玮实验仪器设备有限公司;UV-1800 型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司;超纯水器 重庆力德高端水处理设备;厌氧培养罐 瑞世康科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 益生菌的培养 为了考察模拟肠道环境下益生菌对金属离子的富集作用,采用MRS为细菌培养基,温度控制在37 ℃左右,pH为6.8。采用的MRS培养基成分为:酵母膏5.0 g;吐温80 1.0 mL;乙酸钠5.0 g;磷酸氢二钾2.0 g;柠檬酸氢二铵2.0 g;牛肉膏10 g;硫酸镁0.58 g;硫酸锰0.189 g;葡萄糖20.0 g;蛋白胨10 g;蒸馏水1000 mL,pH调节至6.8,在121 ℃蒸汽灭菌30 min。将实验室保藏的菌种划线接种到MRS固体培养基,37 ℃培养24～32 h,长出单菌落后进行革兰氏染色镜检,确定为纯种,再将纯菌种接种到MRS液体培养基中扩增。接种后,于37 ℃、180 r/min条件下培养,而由于双歧杆菌需要在厌氧静置条件下培养,但为了增加传值,每天摇动培养瓶2～3次。

1.2.2 三种重金属标准曲线的测定

1.2.2.1 六价铬(K2Cr2O7)标准曲线 分别准确移取0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 mL的铬标准溶液(1×10-5mol/L)于7个50 mL容量瓶中,再向每个50 mL容量瓶中加入0.5 mL未加铬离子的空白MRS培养液,依次加入0.6 mL(1+1)H2SO4(1体积浓硫酸加1体积蒸馏水等体积混合)和1.0 mL二苯碳酰二肼溶液,立即混匀,用蒸馏水定容到刻度,再静置反应5 min后,以不加Cr6+溶液为参比,在540 nm波长测定其吸光度,然后绘制吸光度与铬离子浓度的标准曲线[24]。

1.2.2.2 二价镉(Cd(NO3)2)标准曲线 将0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL的10 mg/L的镉标准溶液分别加入到50 mL的容量瓶中,然后加入0.5 mL 未加镉离子的空白MRS培养液,再分别加入5 mL六次甲基四胺-KNO3-HNO3缓冲溶液(pH6.3),4.0 mL的0.1%二甲酚橙水溶液,再用蒸馏水定容到刻度,摇匀静置20 min,于室温25 ℃时,以不加Cd2+溶液为参比,在波长为578.4 nm处测定吸光度并绘制标准曲线[25]。

1.2.2.3 二价铅(Pb(NO3)2)标准曲线 将0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL的100 mg/L的铅标准溶液依次加入到50 mL的容量瓶中,分别加入0.5 mL未加铅离子的空白MRS培养液,然后分别加入2 mL 0.05% 孔雀绿,2 mL pH4.0的Clark-Lubs缓冲溶液,10 mL KI(10%),用蒸馏水定容至刻度,静置反应10 min,以不加Pb2+溶液为参比,在波长为700 nm处测定吸光度并绘制标准曲线[26]。

1.2.3 三种肠道益生菌对三种重金属的吸附特性测定 三种肠道益生菌分别在加入一定浓度重金属离子(六价铬(0.05 mg/L)、二价镉(0.3 mg/L)、二价铅(2 mg/L))的模拟肠道环境的MRS培养基中培养,平行三次。在无菌操作下每隔4 h移取5 mL肠道益生菌(双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌)MRS培养液于离心管中,在4000 r/min下离心10 min后,移取0.5 mL上清培养液于50 mL容量瓶中待测,另取一50 mL容量瓶加入0.5 mL MRS培养液(未加重金属离子)作为对照,依次加入相应的反应试剂(所加试剂与标准曲线测定试剂一致),立即摇匀,用蒸馏水定容至刻度。反应完成后,在相应波长下测定其吸光度,然后由标准曲线计算出溶液中重金属离子的浓度。

2 结果与分析

2.1 三种重金属离子标准曲线的建立

图1 Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三种重金属离子的测定标准曲线Fig.1 Standard curve of Cr6+(a), Cd2+(b)and Pb2+(c)determination

2.2 嗜酸乳杆菌对Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性分析

微生物对重金属的吸附作用机理为:重金属对微生物的生长代谢过程有着非常重要的作用,比如Zn、Ni、Cr等在微生物的生化反应过程中起着催化剂的作用,可以稳定蛋白质的结构、细胞壁以及可以维持渗透压的平衡;而Ag、Cd、Hg、Pb等非必需元素则可以取代结合位点的必需元素,能够与配基反应,从而达到吸附及富集的作用[27]。

嗜酸乳杆菌是一类存在于胃和小肠内具有调整肠道菌群平衡、抑制肠道不良微生物的增殖益生菌。考察了嗜酸乳杆菌在模拟肠道环境的培养过程中对三种重金属离子的吸附特性。从图2曲线a可看出,嗜酸乳杆菌对Cr6+的吸附一直到培养12 h时仍不明显,但在12 h培养后,对Cr6+的吸附能力迅速上升,在培养36 h时吸附率达到最大,吸附率可达初始浓度的70%,吸附量为0.0021 mg/g。然而,在培养36 h后,嗜酸乳杆菌对Cr6+的吸附率逐渐下降,可能由于菌龄的增加、菌体老化、活力降低等因素导致嗜酸乳杆菌对Cr6+的吸附能力下降,在培养48 h时其吸附率降低到初始浓度的36%。由此可以说明嗜酸乳杆菌对Cr6+有较强的吸附和富集作用。从图2曲线b可看出嗜酸乳杆菌直到培养12 h后,对Cd2+的吸附能力才开始逐渐增强,吸附率达到初始浓度的14.3%,在培养36 h时吸附率达到最大,仅为初始浓度的20.6%,由此说明嗜酸乳杆菌对Cd2+有较弱的吸附和富集作用。从图2曲线c可看出,嗜酸乳杆菌对Pb2+未有明显的吸附和富集作用。总之,根据图2可以知道,嗜酸乳杆菌只对Cr6+有较强的吸附特性,同时这种吸附性在一定程度上受到环境的影响(如菌龄、pH等),而对Cd2+只有较弱的吸附能力。

图2 嗜酸乳杆菌对Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三种重金属离子的吸附特性Fig.2 Adsorption characteristics of Cr6+(a),Cd2+(b) and Pb2+(c)by Lactobacillus acidophilus

2.3 嗜热链球菌对Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性分析

嗜热链球菌被认为是“公认安全性(GRAS)”成分,广泛用于生产一些重要的发酵乳制品,包括酸奶和奶酪,且对人体具有多种保健作用,如抗癌、调节血压、延缓衰老等。

考察了嗜热链球菌在模拟肠道环境的培养过程中对三种重金属离子的吸附特性。从图3曲线a可看出,在嗜热链球菌的培养过程中,对Cr6+的吸附在培养16 h前未有明显变化,但在培养16 h后对Cr6+的吸附率迅速上升,在24 h时吸附率达到最大,吸附率达到初始浓度的50%,吸附量为0.0015 mg/g,但在培养24 h后可能由于菌龄等因素的影响,嗜热链球菌对Cr6+的吸附能力下降,在培养40 h时其吸附率降低到初始浓度的38.6%。从图3曲线b可看出,嗜热链球菌对Cd2+也具有较强的吸附和富集作用,培养12 h后吸附能力开始加强,在24 h时达到最大,吸附率达到初始浓度的62%,吸附量为0.1057 mg/g。其后随着培养时间的延长,嗜热链球菌对Cd2+的吸附能力开始下降,在培养40 h时其吸附率降低到初始浓度的39.3%。从图3曲线c可看出,嗜热链球菌对Pb2+未有明显的吸附和富集作用。总之,根据图3可以知道,嗜热链球菌对Cr6+、Cd2+都有较强的吸附特性,但这种吸附性在一定程度上也受到环境的影响(如菌龄、pH等)。

图3 嗜热链球菌对Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三种重金属离子的吸附特性Fig.3 Adsorption characteristics of Cr6+(a),Cd2+(b) and Pb2+(c) by Streptococcus thermophilus

2.4 双歧杆菌对Cr6+、Cd2+、Pb2+的吸附特性分析

双歧杆菌是人体肠道中的一种重要的益生菌,因其末端常常分叉而得名,其保健作用包括:肿瘤防治、保护肝脏、防治心血管疾病等。考察了双歧杆菌在模拟肠道环境的培养过程中对三种重金属离子的吸附特性。从图4曲线a可看出,培养12 h前双歧杆菌对Cr6+的吸附较少,但培养12 h后对Cr6+的吸附率快速上升,32 h时吸附率达到最大,可达初始浓度的66.6%,吸附量为0.0019 mg/g。在培养32 h后双歧杆菌对Cr6+的吸附率开始下降,表明双歧杆菌对Cr6+的吸附能力下降,在培养40 h时其吸附率降低到初始浓度的25.9%,由此可见嗜热链球菌对Cr6+有较强的吸附和富集作用。从图4曲线b可看出,双歧杆菌对Cd2+也具有较强的吸附和富集作用,培养8 h后吸附开始加强,在20 h时达到最大,可达初始浓度的69.9%,吸附量0.1298 mg/g。在随后的培养中双歧杆菌对Cd2+的吸附性能保持稳定,并不随着菌龄的增加而降低,在培养40 h时其吸附量仍可达到初始浓度的67.9%。从图4曲线c可看出,双歧杆菌对Pb2+没有明显的吸附和富集作用。总之,根据图4可以知道,双歧杆菌对Cr6+、Cd2+都有很强的吸附特性。然而,双歧杆菌对Cd2+的吸附并没有受到培养环境的影响,在培养40 h时仍可达到67.9%,这说明双歧杆菌与Cd2+的吸附方式更加稳定。

图4 双歧杆菌对Cr6+(a)、Cd2+(b)和Pb2+(c)三种重金属离子的吸附特性Fig.4 Adsorption characteristics of Cr6+(a),Cd2+(b) and Pb2+(c) by Bifidobacterium

3 结论

通过对嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌培养液中Cr6+、Cd2+、Pb2+的测定,可以发现:嗜酸乳杆菌对Cr6+有较强的吸附和富集作用,在培养12 h时吸附率开始上升,36 h达到最大,随后由于菌龄老化等因素,吸附率开始下降;嗜热链球菌对Cr6+、Cd2+均有较强的吸附和富集作用,在培养16 h时对Cr6+吸附率开始上升,36 h达到最大,而对于Cd2+的吸附率是在培养12 h时开始上升,24 h达到最大,随后嗜热链球菌对这两种离子的吸附率都开始下降;双歧杆菌对Cr6+、Cd2+也有一定的富集作用,对Cr6+的吸附率是在培养12 h后开始上升,32 h时达到最大,随后吸附率开始随着培养时间的延长逐渐下降,而对Cd2+的富集显得更加明显,在培养8 h后吸附率开始上升,20 h时达到最大,且随着培养时间的延长,双歧杆菌对Cd2+的吸附能力并不降低,根据“吸附+细胞膜传输”模型,可能是生长的双歧杆菌对Cd2+具有胞内运输的能力;嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌在模拟肠道环境下对Pb2+均无明显富集作用。该研究的完成进一步了解了肠道益生菌的保健作用,证明了肠道益生菌可通过吸附或胞内运输作用减轻肠道对重金属的吸收,可为其在食品中的进一步应用提供支持。

[1]Bagchi D,Bagchi M,Stohs S J. Chromium(VI)-induced oxidative stress,apoptotic cell death and modulation of p53 tumor suppressor gene[J]. Molecular and Cellular Biochemistry,2001,222:149-158.

[2]Shrivastava R,Upreti R K,Seth P K,et al. Chromium on the immune system[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology,2002,34:1-7.

[3]Mirsalis J C,Hamilton C M,O'Loughlin K G,et al. Chromium(VI)at plausible drinking water concentrations is not genotoxic in theinvivobone marrow micronucleus or liver unscheduled DNA synthesis assays[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis,1996,28:60-63.

[4]Liu R X,Tang H X,Zhang B W. Removal of Cu,Cd and Hg from wastewater by poly(acylaminophosphonic)-type chelation fiber[J]. Chemosphere,1999,38(13):3169-3179.

[5]Nejmeddine A,Fars S,Echab A. Removal of dissolved and particulate form of metals(Cu,Zn,Pb,Cd)by an anaerobic pond system in Marrakesh[J]. Environmental Technology,2000,21(2):225-230.

[6]Srivastava S,Thakur I S. Evaluation of bioremediation and detoxification potentiality of Aspergillus niger for removal of hexavalent chromium in soil microcosm[J]. Soil Biology and Biochemistry,2006,38(7):1094-1911.

[7]Pal A,Ghosh S,Paul A K. Biosorption of cobalt by fungi from serpentine soil of Andaman[J]. Bioresource Technology,2006,97(10):1253-1258.

[8]Say R,Denizli A,Arica M Y. Biosorption of cadmium(II),lead(II)and copper(II)with the filamentous fungus Phanerochaete chrysosporium[J]. Bioresource Technology,2001,76(1):67-70.

[9]Wang J,Chen C. Biosorption of heavy metals by Saccharomyces cerevisiae:A review[J]. Biotechnology Advances,2006,24(5):427-451.

[10]Arjomandzadegan M,Rafiee P,Moraveji M K,et al. Efficacy evaluation and kinetic study of biosorption of nickel and zinc by bacteria isolated from stressed conditions in a bubble column[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2014,7S1:S194-198.

[11]Kan S H,Sun B Y,Xu F,et al. Biosorption of aquatic copper(II)by mushroom biomass Pleurotus eryngii:kinetic and isotherm studies[J]. Water Science and Technology,2015,71(2):283-288.

[12]Dixit S1 Singh D P. Role of free living,immobilized and non-viable biomass of Nostoc muscorum in removal of heavy metals:an impact of physiological state of biosorbent[J]. Cellular and molecular biology(Noisy-le-Grand),2014,60(5):110-118.

[13]陈卫,翟齐啸. 益生菌对食品安全危害因子的拮抗与减除[J]. 中国食品学报,2014,14(11):1-10.

[14]周雨霞,候先志. 益生菌与肠道疾病[J]. 中国微生态学杂志,2006,18(2):147-148.

[15]Didari T,Mozaffari S,Nikfar S,et al. Effectiveness of probiotics in irritable bowel syndrome:Updated systematic review with meta-analysis[J]. World Journal of Gastroenterology,2015,21(10):3072-3084.

[16]董坷,刘晶晶,郭晓奎. 益生菌增强机体免疫和抗肿瘤作用的分子机制[J]. 中国微生态学杂志,2005,17(1):79-81.

[17]薛超辉,张兰威,张迎春,等. 筛选具有抑制引起腹泻致病菌黏附功能的益生菌[J]. 食品工业科技,2015,36(2):227-230.

[18]张娟,杨彩梅,曹广添,等. 解淀粉芽孢杆菌及其作为益生菌的应用[J]. 动物营养学报,2014,26(4):863-867.

[19]陈佩,党辉,张秋香,等. 1株具有潜在降糖作用的益生菌的筛选[J]. 中国食品学报,2014,14(11):27-33.

[20]Miller D D,Schricker B R,Rasmussen R R,et al. An in-vitro method for estimation of iron availability form meals[J]. American Journal of Clinical Nutrition,1981,34(10):2248-2256.

[21]徐丽丹,邹积宏,袁杰利. 一株降血压功能乳酸菌在模拟胃肠环境中抗性的研究[J]. 中国微生态学杂志,2011,23(2):112-114.

[22]赖文,刘书亮,张倩颖,等. 降胆固醇乳酸菌鉴定及其在体外模拟胃肠环境中抗性研究[J]. 中国酿造,2011,3:90-93.

[23]张东平,余应新,张帆,等. 环境污染物对人体生物有效性测定的胃肠模拟研究现状[J]. 科学通报,2008,53(21):2537-2545.

[24]裴翠锦,姚国光,周福林,等. 紫外分光光度法测定水中铬(VI)的方法研究[J]. 湖北农业科学,2009,48(4):4-5.

[25]蒋桂华,王晓菊,唐燕红,等. 分光光度法测定海产品中微量镉[J]. 光谱学与光谱分析,1999,19(3):474-475.

[26]吴霖生,任炜. 分光光度法水相快速测定铅[J]. 滁州学院学报,2008,10(5):65-66.

[27]吴海江,茆灿泉,郭红光. 微生物与重金属作用机理研究[J]. 安徽农业科学,2009,37(11):5068-5071.

Study on the enrichment of intestinal probiotics to three heavy metal ions under simulated intestinal environment

ZHANG He,LUO Cheng-yin,FU Xin

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan Institute of Engineering,Xiangtan 411104,China)

In this paper,the absorption characteristics ofLactobacillusacidophilus,StreptococcusthermophilusandBifidobacteriumto Cr6+、Cd2+、Pb2+under the simulated intestine environment were studied. The results indicated theLactobacillusacidophilushad strong adsorption and enrichment to Cr6+,and the adsorption ratio was 70% and the adsorption amount was 0.0021 mg/g.Streptococcusthermophilusalso had strong adsorption and enrichment to Cr6+and Cd2+,and the adsorption ratio was 50% and 62%,and the adsorption amount was 0.0015 mg/g and 0.1057 mg/g,respectively.Bifidobacteriumalso had strong adsorption and enrichment to Cr6+and Cd2+,and the adsorption ratio was 66.6% and 69.9%,and the adsorption amount was 0.0019 mg/g and 0.1298 mg/g,respectively. There was no obvious adsorption of Pb2+among the three kinds of intestinal probitics under simulated intestinal environment.

intestinal probiotics;intestinal environment;heavy metal ions;enrichment

2015-01-23

张何(1977-),男,博士,副教授,研究方向:生物分析化学,E-mail:mzhang_he@126.com。

湖南省自然科学基金(2015JJ2039,14JJ3133);湖南省教育厅优秀青年基金(12B029);湖南工程学院博士启动基金。

TS201.4

A

1002-0306(2015)21-0349-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.064