结直肠肿瘤组织miR-215表达及临床意义

娄杰，刘华，毛涛，丁雪丽，孔心涓，赵清喜

(青岛大学附属医院消化内科，山东 青岛 266003)



·肿瘤专题·

结直肠肿瘤组织miR-215表达及临床意义

娄杰，刘华，毛涛，丁雪丽，孔心涓，赵清喜

(青岛大学附属医院消化内科，山东 青岛 266003)

目的 研究microRNA-215(miR-215)在结直肠肿瘤组织和病人血清中的表达水平及其临床意义。方法 从结直肠癌、结直肠腺瘤病人病变组织及健康查体者(正常对照组)结直肠组织和血清标本中提取微小RNA(microRNA)，应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测miR-215的表达，分析miR-215表达水平与结直肠肿瘤临床病理参数间的关系，并通过绘制受试者工作曲线(ROC曲线)探讨血清miR-215在结直肠肿瘤诊断中的价值。结果 与正常对照组比较，miR-215在结直肠癌和结直肠腺瘤病变组织中表达显著降低，差异有显著性(F=16.603，t=5.756、3.572，P<0.01)；miR-215在结直肠癌和结直肠腺瘤病人血清中的表达也低于正常对照组，差异有显著性(F=27.329，t=7.377、4.691，P<0.01)；与结直肠腺瘤组相比，结直肠癌组miR-215表达下调(t=2.182、2.671,P<0.05)。结直肠癌组织和病人血清中miR-215的低表达与病人的临床分期有关(F=4.073、6.125，P<0.05)，且结直肠癌组织与血清中miR-215的表达量呈正相关(r=0.696,P<0.01)；miR-215表达与结直肠腺瘤临床特征无关(P>0.05)。ROC曲线分析显示，结直肠癌和正常对照组血清miR-215的ROC曲线下面积(AUC)为0.855(95%CI=0.740～0.970)，结直肠腺瘤与正常对照组血清miR-215的AUC为0.774(95%CI=0.634～0.913)。结论 miR-215在结直肠癌的早期诊断中具有潜在的价值。

结直肠肿瘤；聚合酶链反应；组织；血清；微RNAs

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤，在癌症引起死亡的原因中占第4位，并呈上升趋势。结直肠腺瘤是结直肠癌主要的癌前病变。结直肠癌早期症状不典型，大多数病人确诊时已属中晚期，目前虽有多种治疗方法，如手术、放化疗等，但预后均不理想[1]，因此，早期诊治是提高病人预后的关键。目前，诊断结直肠癌的金标准为结肠镜检查及组织活检，但二者均为侵入性检查，暂时难以普及；而传统血清肿瘤标记物如癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)等灵敏度及特异度低，因此限制了结直肠癌的早期诊断。微小RNA(microRNA)是一类内源性的非编码RNA，在转录后水平调控基因表达，参与多种细胞过程[2]。研究已表明，肿瘤组织或外周血中多种microRNAs的表达异常与结直肠癌的发生发展有关[3-4]。microR-215(miR-215)是受P53诱导表达的一个microRNA,在肿瘤进展和转移中起重要作用[5]。研究显示，miR-215在胃癌高表达[6]，在肾癌低表达[7]，但其在结直肠癌表达的研究较少。本文检测结直肠癌、结直肠腺瘤病人及正常对照者肿瘤组织和血清miR-215表达水平，分析其表达量与结直肠肿瘤临床病理特征关系，探讨血清miR-215检测对结直肠癌早期诊断价值。

1 对象与方法

1.1研究对象

收集我院2014年4—8月诊治结直肠癌病人46例、结直肠腺瘤病人38例及健康查体者(正常对照组)30例的结直肠组织和血液标本，病变组织诊断均经术后病理证实，血液标本均为术前获得。结直肠癌46例中，男26例，女20例，年龄29～81岁，中位年龄65岁；按照美国癌症联合委员会(AJCC)-国际抗癌联盟(UICC)联合制定的TNM分期系统进行临床分期；所有病人术前均未接受放化疗或免疫治疗等，且无其他部位肿瘤史。结直肠腺瘤38例中，男20例，女18例，年龄31～82岁，中位年龄63岁。正常对照组男16例，女14例，年龄29～79岁，中位年龄62岁；其结肠镜、CT等检查阴性，CEA、CA19-9等指标未见异常，无肿瘤病史。

1.2方法

1.2.1标本处理 采集组织标本后立即放至液氮中，然后置于-80 ℃冰箱冻存待用。收集待检者外周血2 mL，于室温静置30 min，然后于4 ℃离心机以2 675 r/min和8 459 r/min分别离心10 min，吸取上清至新离心管中，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2细胞总RNA提取 称取约100 mg组织，吸取200 μL血清于离心管中，应用常规TRIzol试剂提取总RNA，分光光度计检测RNA溶液的A260/280比值，取A260/280为1.8～2.1者进一步实验。

1.2.3cDNA的合成以及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测 取上述提取RNA 1 μL，按照SYBR®PrimeScriptTMmiRNA RT-PCR Kit(TaKaRa)试剂说明书将其逆转录为cDNA，然后取逆转录产物在LightCycler Real Time PCR扩增仪上进行RT-PCR反应，反应均设3个复孔，并设不加模板cDNA的反应管作为阴性对照。计算各管Ct值，以U6作为内参，以2-△CT表示miR-215的相对表达量。

1.3统计学方法

应用SPSS 18.0软件进行数据分析,计量资料比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较应用Bonferroni法；应用Pearson相关性检验进行相关性分析，受试者工作曲线(ROC曲线)评估血清miR-215在结直肠肿瘤诊断中的价值；以P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1各组结直肠肿瘤组织及血清中miR-215的表达水平比较

与正常对照组比较，结直肠癌组和结直肠腺瘤组病变组织中miR-215表达显著降低(F=16.603,t=5.756、3.572，P<0.01)，其对应病人血清中miR-215的表达水平也显著降低(F=27.329，t=7.377、4.691，P<0.01)；与结直肠腺瘤组比较，结直肠癌组病变组织和病人血清中miR-215表达均下降(t=2.182、2.671,P<0.05)。见表1。

2.2miR-215表达与肿瘤临床病理参数的关系

结直肠癌组织和病人血清中miR-215表达下降与肿瘤的临床分期有关，肿瘤分期越晚，miR-215表达下降越显著(F=4.073、6.125，P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤细胞分化程度、有无淋巴结转移及CEA水平无关(P>0.05)。见表2。结直肠腺瘤组织和病人血清中miR-215的低表达与结直肠腺瘤的临床病理特征均无关(P>0.05)。见表3。

2.3结直肠癌组织和血清miR-215表达相关性

结直肠癌组织与对应病人血清中miR-215表达量存在明显相关性(r=0.696,P<0.01)。

2.4血清miR-215诊断结直肠肿瘤的效能

ROC曲线分析结果显示，miR-215鉴别结直肠癌与正常对照组、结直肠腺瘤与正常对照组的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.855(95%CI=0.740～0.970)和0.774(95%CI=0.634～0.913)。当最佳截断值为0.347 3和0.318 8时，其诊断的灵敏度和特异度分别为72.2%、77.8%和86.1%、78.6%。见图1。

3 讨 论

近年来，大量研究显示，miRNA与多种肿瘤的发生发展有密切的关系[8-9]。由于miRNA表达稳定，其在肿瘤的诊断、预后评价及疗效评估方面有潜在的价值[10]。miR-215通过调控细胞周期检验点蛋白的表达，可能起抑癌基因的作用[5]。miR-215与肿瘤关系密切，已有研究显示，其在肾癌、食管癌等肿瘤组织中表达下调[7,11]。KARAAYVAZ等[12]应用荧光定量PCR检测组织中miR-215的表达，结果显示，结肠癌组织中miR-215表达较正常降低，且miR-215表达水平与结肠癌病人的预后有关，提示miR-215可能作为结肠癌新的标志物和预后观察指标。目前报道多研究癌及其癌旁组织中miR-215的表达，且研究较少，关于miR-215在结直肠腺瘤病人血清中的表达情况目前尚不明确。

表2 miR-215表达与结直肠癌临床病理参数的关系

表3 miR-215表达与结直肠腺瘤临床病理参数的关系

a：结直肠癌与对照组；b：结直肠腺瘤与对照组。

本研究应用RT-qPCR检测结直肠癌组织和病人血清中miR-215的表达水平，结果显示，与正常对照组比较，miR-215在结直肠癌组织和病人血清中表达下调，差异有显著性。与吴旭波等[13]的研究结果一致。CHIANG等[14]检测107例结直肠癌组织及其癌旁正常组织中miRNA的表达，结果显示，miR-215在癌组织中的低表达与肿瘤大小有关，肿瘤体积越大，miR-215下降越明显。本研究对结直肠癌组织和病人血清中miR-215表达水平与临床病理参数分析结果显示，miR-215低表达与肿瘤的临床分期有关，这与FALTEJSKOVA等[15]的结果一致，提示miR-215可能在肿瘤细胞浸润中发挥重要作用。另外，本研究同时检测miR-215在结直肠腺瘤组织及病人血清中的表达情况，结果显示，腺瘤组织和病人血清中miR-215也呈现低表达，但未发现其表达与临床特征(年龄、性别、部位、腺瘤大小、病理类型等)有关，可能与样本量不足有关。根据本研究结果，miR-215在结直肠腺瘤、结直肠癌中的表达较正常对照组依次下调，推测miR-215可能在结直肠癌早期病变中即发挥作用，结果有待更大样本的研究证实。

目前，诊断结直肠癌的传统血清肿瘤标记物灵敏度及特异度低[16]，限制了其早期诊断。本研究应用ROC曲线对miR-215的诊断效能进行评估，结果显示，血清miR-215鉴别结直肠癌的灵敏度为72.2%，特异度为77.8%；鉴别结直肠腺瘤的灵敏度为86.1%，特异度为78.6%，提示miR-215对结直肠肿瘤诊断有一定价值。同时，本文结果还显示，结直肠癌组织和病人血清中miR-215的表达具有相关性，提示有可能通过检测血清miR-215水平来区分结直肠癌和结直肠腺瘤病人，这使得miR-215的血液检测成为可能。随着对血清miRNA在肿瘤中异常表达研究的深入，对血清中miRNA出现机制的进一步阐明，血清miRNA有望成为结直肠癌早期筛查的非侵入性手段之一。

同时，该研究存在一定的局限性，如标本取自同一地区、人群，且总样本量不足等。虽然对结直肠肿瘤发展的不同阶段中miRNA-215的表达进行了研究，但血清miR-215的异常表达是否与实体肿瘤自身有关，还是疾病进展过程中宿主免疫应答的表现，这仍存在疑问，若能对结直肠癌和结直肠腺瘤病人术后7 d血清标本进行检测，而且术后病人血清中miR-215的表达升高，将进一步证明血清miRNA在结直肠肿瘤诊断中的价值。

综上所述，miR-215在结直肠肿瘤组织和病人血清中低表达，其在结直肠肿瘤的诊断中具有潜在的价值，但将其应用于临床，仍需进一步大规模的研究证实。

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(本文编辑 黄建乡)

THE EXPRESSION OF MIR-215 IN COLORECTAL NEOPLASMS AND ITS CLINICAL SIGNIFICANCE

LOUJie,LIUHua,MAOTao,DINGXueli,KONGXinjuan,ZHAOQingxi

(Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore miR-215 expression in tumor tissues and in serum in patients with colorectal neoplasms and its clinical significance.MethodsMicroRNA was extracted from tissues of colorectal cancer, colorectal adenoma and healthy individuals who came for medical examination. The expression of miR-215 was detected using quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The relationship between the level of miR-215 expression and clinicopathological parameters in colorectal neoplasms was analyzed, and the value of serum miR-215 in the diagnosis of colorectal tumors was evaluated through drawing a receiver operating characteristic (ROC) curve.ResultsCompared with normal controls, the expression of miR-215 in tissues of colorectal cancer and colorectal adenoma was lower (F=16.603;t=5.756,3.572;P<0.01), and that in serum was also lower (F=27.329;t=7.377,4.691;P<0.01). Compared with colorectal adenoma, the expression of miR-215 in colorectal cancer was down-regulated (t=2.182,2.671;P<0.05). Low expression of miR-215 in cancer tissue and serum was associated with clinical stage of the disease (F=4.073,6.125;P<0.05), and the expression of miR-215 in cancer was positively correlated with that in serum (r=0.696,P<0.01), but the expression of miR-215 was not correlated with clinical features of colorectal adenoma (P>0.05). ROC curve analysis demonstrated that the area under the ROC curve of serum miR-215 in the cancer and normal control group was 0.855 (95%CI=0.740-0.970) and that in the adenoma and normal control was 0.774 (95%CI=0.634-0.913).ConclusionThere is a potential value of miR-215 in early diagnosis of colorectal cancer.

colorectal neoplasms; polymerase chain reaction; tissue; serum; micrornas; polymerase chain reaction

2015-04-13;

2015-09-02

娄杰(1989-)，女，硕士。

赵清喜(1966-)，男，硕士，主任医师，硕士生导师。

R735.3

A

1008-0341(2015)06-0631-04