6种人DNA甲基转移酶3B典型异构体的克隆、表达及对293A细胞增殖的影响

张柱霞，孙明英，杨 洁，姜树原，石 蕊，闫少春*，邵 国，2*

(1.包头医学院 生物医学研究中心 基础医学部，内蒙古 包头014010;2.首都医科大学附属宣武医学院低氧医学研究所，北京100053)

哺乳动物细胞胞嘧啶的甲基化是细胞分裂后的细胞记忆形成的至关重要的表观遗传学事件，而到目前为止，具有催化活性的C5 甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)共有3种，DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B。DNMT1的主要作用是在DNA 复制中催化新合成的DNA 子链(半甲基化DNA)的甲基化，从而维持基因组DNA甲基化的模式，而DNMT3A 和3B的主要作用是催化DNA 建立新的DNA甲基化模式。维持型DNA甲基转移酶(DNMT1)和从头合成型甲基转移酶(DNMT3A 和DNMT3B)功能并非泾渭分明，它们之间协同作用来对DNA 进行修饰[1]。

到目前，发现人类DNMT3B 由于剪接/转录起始点的差异造成有近40种异构体[2-5]，DNMT3B1是最大的DNMT3B，其cDNA是4 195 bp，编码859个氨基酸[2]。其余的异构体与DNMT3B1 相比可以大致分为4类:1)DNMT3B3-5 和DNMT3B7 缺少DNMT3B的C 末端;2)ΔDNMT3B 家族缺少DNMT3B的N 末端[3-5];3)DNMT3BΔ5 和DNMT3BΔ(4+5)缺少DNMT3B的靠近PWWP 结构域的一些氨基酸序列[6];4)DNMT3B2和DNMT3B6 保留了几乎与DNMT3B1 相同的序列[7]。

虽然人们对DNMT3B异构体进行了部分研究，但其功能尚不十分明了，本研究通过克隆人DNMT3B 典型6种异构体并建立真核表达载体以及其稳定过表达细胞株，对DNMT3B 典型6种异构体进行初步系统研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

HCT116细胞(上海细胞所);293A细胞(北京协和医学院基础学院细胞中心);Trizol(Gibcobrl 公司);反转录试剂盒(Invitrogen 公司);限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ(Takara 公司);Expand High Fidelity PCR System 及rapid ligation Kit (Roche 公司);DNA 回收试剂盒(Qiagen 公司)。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取，RT-PCR 及PCR:利用Trizol 试剂从HCT116细胞中分离总RNA，按照反转录试剂盒得到cDNA，利用Expand High Fidelity PCR System进行扩增，所有异构体的正向引物序列为CGGGATCCAAGGGAGACACCAGGCATCTC，DNMT3B1、DNMT3B2和DNMT3B3的反向引物序列为5'-GCGA ATTCTCACACCTCCTGGGTCCTGGCTC-3'，DNMT3-B4、DNMT3B5 和DNMT3B7的反向引物序列分别为5'-GCGAATTCCTGTTCATCCCGGGTAGG-3'、5'-GCGA ATTCCATGCAAAGTAGTCCTTC-3'和5'-GCGAATTCATATGCCTGGGTACCAGC-3'，其中GGATCC 为BamHⅠ酶切位点和GAATTC 为EcoR Ⅰ酶切位点。扩增条件为94℃变性5 min;94℃、30 s，56℃、60 s，72℃、300 s，30个循环;72℃延伸8 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳验证PCR 产物，将大小正确的扩增产物用Qiagen PCR 产物回收试剂盒进行回收。

1.2.2 pCMV-DNMT3B异构体真核表达载体的构建及鉴定:BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制性酶分别酶切回收的DNMT3B异构体的片段及pCMV-2B 载体，将酶切的载体和异构体片段用PCR 产物纯化试剂盒纯化后用rapid ligation kit 进行连接。将DNMT3B异构体的连接产物转化感受态细菌DH5α，将转化后的细菌涂在含有Amp的平板上过夜后挑取单个克隆，扩大培养利用质粒提取试剂盒提取质粒。将提取的重组质粒分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切。将酶切鉴定正确的重组质粒送上海生物工程公司进行测序。

1.2.3 稳定表达DNMT 异构体的细胞株的建立转染:人胚肾293A细胞培养于含10% 新生牛血清RPMI1640 培养基的6孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞汇合至70%～80%左右时，使用FUGENE HD 试剂将6种DNMT3B 重组质粒转染293A细胞，同时转染空质粒pCMV-2B 作为对照。转染2 d后将培养基中加入700 μmol/L的G418 对细胞筛选，10 d后将滤纸用胰蛋白酶浸湿后覆盖在单克隆上，消化后再把滤纸上的细胞洗脱在96孔板里培养，扩大培养后利用real-time PCR 选取高表达细胞株即为稳定表达异构体的克隆株。

利用real-time PCR 和Western blot 技术[7]对稳定表达异构体的克隆株在mRNA 和蛋白水平上进行鉴定。

1.2.4 MTT法检测细胞活力:各种过表达DNMT3B表达异构体的细胞接种于96孔板(5×103细胞/孔)，培养24 h后开始检测，连续检测4 d，每天随机选3个孔加入20 μL MTT(5 g/L)继续培养3 h，去上清后加入150 μL DMSO 振荡10 min后使用酶标仪检测490 nm 波长处的吸光度值(A)，以培养天数(D)为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。

1.3 统计学分析

用SPSS10.0 数据统计软件ANOVA 和Tukey对组间数据进行处理和分析，数值以均值±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 6种DNMT3B异构体重组质粒的构建及鉴定

6种DNMT3B异构体琼脂糖凝胶电泳鉴定为1.1 kb～2.7 kb 大小的异构体片段和4.3 kb的pCMV-2B载体骨架(图1)。其序列与GenBank 登记的人DNMT3B异构体序列相同。

2.2 稳定过表达DNMT3B异构体细胞系的建立

G418 筛选得到高表达DNMT3B异构体的细胞株，其在mRNA 及蛋白水平上都表达升高(图2，3)。

图1 质粒PCMV-3B1、3B2、3B3、3B4、3B5 和3B7的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切电泳图Fig1 Electrophoresis of recombination plasmids of DNMT3B isoforms digested by EcoR Ⅰand BamH Ⅰin agarose gel

图2 稳定转染DNMT3B异构体细胞异构体mRNA相对转染空质粒细胞异构体mRNA倍数Fig2 Relative abundance DNMT3B mRNA in stable over-expression DNMT3B isoform cell line to in control cell line(n=3)

图3 Western 检测DNMT 3B1、2、3、4、5、7 及空PCMV 在293A细胞中蛋白的表达Fig3 Western blot analysis of the over-expression protein in 293A cell line which transfected with DNMT 3B1，2，3，4，5，7 and pCMV-vector

2.3 稳定过表达DNMT3B异构体对293A细胞增殖的影响

将过表达DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5 和DNMT3B7 以及空载体的细胞培养于96孔板后4天时间内，第4 天实验组和对照组的细胞增殖情况见表1，第4 天293A-DNMT3B7-1 和293A-DNMT3B7-2的A值分别是293A-vector的A值的48.43% 和58.49%;293A-DNMT3B4-1 和293ADNMT3B4-2的A值分别是293A-vector的A值的58.92% 和68.83%;293A-DNMT3B3-1 和293A-DNMT3B3-2的A值分别是293A-vector的A值的60.03% 和62.03% (P＜0.01)(图4)。

表1 MTT法测定过表达DNMT3B异构体第4天细胞数量(490 nm)Table1 The amount of cells which over-expression DNMT3B isoform on the 4th day by MTT method(490 nm)

图4 MTT法分析DNMT3B异构体过表达对293A细胞增殖的影响Fig4 MTT analysis of the effect of over-expression DNMT3B isoform on the proliferation of 293A

3 讨论

剪接/转录起始点的差异造成了DNMT3B 有近40种异构体或拼接体[2-5]。典型的DNMT3B的异构体与DNMT1类似或缺少C 末端的，由于C 末端有甲基转移酶的结构域，其中结构域Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ为保守结构域，这些结构域对于甲基转移酶活性是必需的。DNMT3B3 缺少结构域Ⅷ;DNMT3B4缺少结构域Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ;DNMT3B5 在结构域缺Ⅵ之后氨基酸序列发生变化，也缺少保守结构域Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ;DNMT3B7 终止于内含子10，其缺少C端催化序列[8-9]，因而推测这4种都无甲基转移酶活性。

将克隆的6种异构体转入293A细胞观测其对细胞生长的影响，结果显示稳定过表达DNMT3B3、DNMT3B4 和DNMT3B7 降低了细胞的增殖速度。有研究报道分离DNMT3A 与DNMT3B 并检测其甲基转移酶活性，发现DNMT3A 与DNMT3B 甲基转移酶活性较其他种类的甲基转移酶活性低很多，而将两者混合的活力则比二者单独测总和高40%。因此，在生物体内两种甲基转移酶可能通过蛋白-蛋白相互作用来发挥其生物学作用，推断异构体不影响两者相互作用[10]。同时，无活性的异构体DNMT3B3和DNMT3B4 可以结合并调节有催化活性的DNMT3A 和DNMT3B 分子的催化活力[11]。因而当过表达没有活性的DNMT3B的异构体则可能干扰有活性的DNMT3B的异构体与DNMT3A的相互作用而影响DNA甲基化，而DNA甲基化变化则很可能对于细胞周期产生影响。结果显示DNMT3B3、DNMT3B4 和DNMT3B7 降低了细胞增殖速度可能是缘于此。有趣的是DNMT3B5 同DNMT3B7 等一样是无甲基转移酶活力的异构体，但过表达DNMT3B5 对细胞的增殖速度并没有产生明显的影响。不同的异构体在细胞核中的定位不同，其生物学功能可能有差异[6]。因此无活性的DNMT3B5 可能由于细胞定位的差异不影响有催化活力的DNMT3A 和DNMT3B，所以过表达不影响其细胞增殖。

本文克隆并构建了6种DNMT3B异构体真核表达载体，将6种异构体稳定表达于293A细胞中并初步研究了其对细胞生长的影响。DNMT3B的异构体由于其有无甲基转移酶活力而对细胞的增殖产生了差异，但无转移酶活力的DNMT3B5 与其他的无活力的DNMT3B异构体的作用不同，所以不同的DNMT3B异构体的功能可能差异较大，仅仅从有无转移酶活力还不能明确其对细胞的作用，因而要明确各种异构体的功能仍需进一步的研究。

[1]Kim GD，Ni J，Kelesoglu N，et al.Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5)methyltransferases [J].EMBO J，2002，21:4183-4195.

[2]Okano M，Xie S，Li E.Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5)methyltransferases[J].Nat Genet，1998，19:219-220.

[3]Wang J，Bhutani M，Pathak AK，et al.Delta DNMT3B variants regulate DNA methylation in a promoter-specific manner[J].Cancer Res，2007，67:10647-10652.

[4]Wang J，Walsh G，Liu DD，et al.Expression of Delta DNMT3B variants and its association with promoter methylation of p16 and RASSF1A in primary non-small cell lung cancer[J].Cancer Res，2006，66:8361-8366.

[5]Wang L，Wang J，Sun S，et al.A novel DNMT3B subfamily，DeltaDNMT3B，is the predominant form of DNMT3B in non-small cell lung cancer [J].Int J Oncol，2006，29:201-207.

[6]Gopalakrishnan S，Van Emburgh BO，Shan J，et al.A novel DNMT3B splice variant expressed in tumor and pluripotent cells modulates genomic DNA methylation patterns and displays altered DNA binding[J].Mol Cancer Res，2009，7:1622-1634.

[7]Shao G，Zhang R，Zhang S，et al.Splice variants DNMT3B4 and DNMT3B7 overexpression inhibit cell proliferation in 293A cell line[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，2013，49:386-394.

[8]Saito Y，Kanai Y，Sakamoto M，et al.Overexpression of a splice variant of DNA methyltransferase 3b，DNMT3b4，associated with DNA hypomethylation on pericentromeric satellite regions during human hepatocarcinogenesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99:10060-10065.

[9]Shah MY，Vasanthakumar A，Barnes NY，et al.DNMT3B7，a truncated DNMT3B isoform expressed in human tumors，disrupts embryonic development and accelerates lymphomagenesis[J].Cancer Res，2010，70:5840-5850.

[10]Li JY，Pu MT，Hirasawa R，et al.Synergistic function of DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b in the methylation of Oct4 and Nanog[J].Mol Cell Biol，2007，27:8748-8759.

[11]Gordon CA，Hartono SR，Chedin F.Inactive DNMT3B splice variants modulate de novo DNA methylation [J].PLoS One，2009，8:e69486.doi:10.1371/journal.pone.0069486.