猪细小病毒3型VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

王广操，崔鹏超，何 玉，张梦岩，苑文涛，王先炜

(南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏 南京 210095)

猪细小病毒 3型(Porcine parvovirus 3，PPV3)已相继于香港[1]， 德国[2]、 罗马尼亚[3]和匈牙利[4]等地区和国家报道。PPV3属于Hokovirus属，基因进化树显示PPV3与人细小病毒4型、5型(PARV4/5)和牛细小病毒4型(Bovine parvovirus，BPV4)的同源性很高，3者处于同一进化分支[5-6]。近年来研究发现该病的感染率越来越高，并且存在突破种属屏障的可能。Cadar报道称，2006年～2007年 PPV3在罗马尼亚的检出率为22.8%，2010年～2011年检出率为50.5%[7]；Csa'gola等认为PPV3正处在突破种属屏障、逐渐适应新宿主的过程[8]。感染范围广、适应能力强是PPV3的主要特征。

目前PPV3的检测方法研究局限于PCR检测和基因测序。研究表明，PPV3的结构蛋白能够识别不同宿主细胞的特异性受体，这对其侵入机体起着至关重要的作用[9]。因此，本研究通过原核表达PPV3 VP2蛋白的主要抗原表位区蛋白，初步建立了检测PPV3的间接ELISA方法，为PPV3早期感染的提供了有效的检测方法。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 pET-28a载体、E.coliDH5α、E.coliBL21均由本实验室保存；PPV3阴、阳性血清和376份血清均筛选自临床送检样品；猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪圆环病毒 2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒 1型(PPV1)和PPV2等阳性血清均由本实验制备保存。辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)购自武汉博士德生物工程有限公司；四甲基联苯胺(TMB)购自碧云天生物技术研究所；限制性内切酶、2×Taq Master Mix、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker均购自TaKaRa公司；DNA回收试剂盒购自上海鼎国生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自Biomiga公司。……