琼脂扩散试验的影响因素及注意事项

刘坤洋

琼脂扩散试验包括琼脂双向单扩散试验和琼脂双向双扩散试验，后者是最常用的琼脂扩散试验，一般用于抗体或抗原的定性检测，其原理是可溶性抗原与相应的抗体（抗血清）在琼脂凝胶中向四周自由扩散，如果抗原和抗体相对应，则在二者比例适当处形成肉眼可见的白色沉淀线，反之则不会出现沉淀线。常用已知抗原检测未知的血清样本，也可用已知抗血清检测未知抗原样本。

1 琼脂扩散试验的影响因素

1.1 琼脂板的制备

琼脂板的质量、浓度、黏度、厚度、湿度等都会影响琼脂扩散试验的结果，琼脂浓度越低，则孔径越大，扩散速度也会越快；如果琼脂浓度越大，那么琼脂的黏度也会随之增大，扩散速度会相对减慢，建议使用较好的琼脂（琼脂糖），最适浓度为1%，厚度约2.5毫米，注意倒热融化琼脂液时不要产生气泡，而且空气中的湿度很低，琼脂中的水分容易蒸发，待琼脂冷凝后加盖，把平皿倒置，放在装有湿纱布的搪瓷盘中，防止水分蒸发，保证湿度。

1.2 打孔

打孔是琼脂扩散试验中的关键，反应孔应现用现打，放在4℃冰箱中过夜后再使用。实验室常用梅花打孔器，然后用针头挑出内容物。用此种方法在打孔的过程中，注意挑出空内容物时避免将凝胶划破，否则可造成孔与孔之间产生裂痕，产生错误的实验结果。如果试验检测的样品数量不是很多，还可以将若干梅花打孔器先放在空平皿中，孔口朝下，向平皿中倒入稍冷却的热融化琼脂液，之后迅速并平稳地放入4℃冰箱中，冷却后取出平皿，逐个轻轻拔出打孔器，根据实验需要重复此操作。……