化浊颗粒对2型糖尿病大鼠磷脂酰肌醇3激酶和葡萄糖转运蛋白4基因表达的影响

康学东 李菲 杨维杰 余臣祖

摘要：目的 观察化浊颗粒对2型糖尿病（T2DM）大鼠磷脂酰肌醇3激酶（PI-3K）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）在骨骼肌组织中表达的影响，探讨其对PI-3K及GLUT4信号通路激活的作用。方法 采用高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射建立T2DM大鼠模型，随机分为化浊颗粒组、罗格列酮组、模型组。各给药组给予相应药物灌胃，模型组与空白组予生理盐水灌胃，观察大鼠一般状态、体质量及摄食量。干預10周后，予10%水合氯醛麻醉大鼠，检测大鼠空腹血糖（FBG）、葡萄糖耐量试验餐后2 h血糖（2 h PG）、空腹胰岛素（FINS）水平；RT-PCR检测各组大鼠骨骼肌组织PI-3K和GLUT4 mRNA表达的水平。结果 与模型组比较，化浊颗粒组与罗格列酮组大鼠FBG、2 h PG及FINS水平降低（P<0.05），PI-3K及GLUT4 mRNA表达水平升高（P<0.05）。结论 化浊颗粒具有提高胰岛素敏感性的作用，与激活骨骼肌组织胰岛素信号传导通路中PI-3K和GLUT4 mRNA的表达有关。

关键词：化浊颗粒；2型糖尿病；胰岛素抵抗；磷脂酰肌醇3激酶；葡萄糖转运蛋白4；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.019

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0067-04

Effects of Huazhuo Granule on Expressions of PI-3K and GLUT4 mRNA in Rats with Type 2 Diabetes KANG Xue-dong1， LI Fei2， YANG Wei-jie1， YU Chen-zu2 （1.The Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China；2.Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Huazhuo Granule on expression of phosphatidylinositol-3-kinase （PI-3K） and glucose transporter 4 （GLUT4） in skeletal muscle type 2 diabetes （T2DM） rats；To discuss its effects on activating signal path of PI-3K and GLUT4. Methods High-fat diet combined with low-dose streptozotocin intraperitoneal injection was used to establish T2DM rat models. The rats were randomly divided into blank group， Huazhuo Granule group， rosiglitazone group， and model group. Each treatment group was given relevant medicine for gavage. Model group and blank control group were given normal saline for gavage. The general state， weight， and food ration of rats were observed. After ten-week medicine intervention， 10% chloral hydrate was used for anesthesia to detect the levels of FBG， OGTT （2 h PG）， and FINS. RT-PCR was used to detect the expressions of PI-3K and GLUT4 mRNA of rat skeletal muscle in all groups. Results Compared with model group， the levels of FBG， 2 h PG， and FINS decreased （P<0.05）；the expressions of PI-3K and GLUT4 mRNA of rat skeletal muscle increased significantly （P<0.05）. Conclusion Huazhuo Granule has the effects on increasing insulin sensitivity， which is related to activating insulin signal path of PI-3K and GLUT4 of skeletal muscle tissues.

Key words：Huazhuo Granule；type 2 diabetes；insulin resistance；PI-3K；GLUT4；rats

基金项目：甘肃省教育厅研究生导师科研项目计划（1206-06）

通讯作者：李菲，E-mail：wowofiona@163.com

[8] Yini Jiang， Daobing Liu， Xiangying Kong， et al. Huogu I formula prevents steroid-induced osteonecrosis in rats by down- regulating PPARγ expression and activating Wnt/LRP5/β-catenin signaling[J]. Journal of Tranditional Chinese Medicine，2014， 34（3）：256-264.

（收稿日期：2014-12-13；编辑：华强）

2型糖尿病（T2DM）是一组由多原因引起的以慢性高血糖为特点的代谢性、系统性疾病，其病理机制是胰岛素分泌不足/或胰岛素抵抗（IR）。现代医学认为，

IR是糖尿病发病的中心环节，不仅贯穿于T2DM的发生、发展的始末，同时也是导致T2DM各种合并症的根源[1]。化浊颗粒是依据中医浊毒理论组方的中药复方制剂，前期研究表明，其可降低非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟指数、减轻非酒精性脂肪肝大鼠的IR[2-3]。本实验观察化浊颗粒对T2DM大鼠骨骼肌组织胰岛素信号通路中磷脂酰肌醇3激酶（PI-3K）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4） mRNA表达的影响，进一步阐述其改善IR的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

雄性SPF级Wistar大鼠60只，4月龄，体质量（200±20）g，甘肃中医学院实验中心提供，合格证号SCXK（甘）2011-0001。

1.2 药物

化浊颗粒（黄连、黄柏、鸡内金、山楂、枳壳、丹参组成），甘肃中医学院附属医院制剂科提供，批号20130423；罗格列酮片，太极集团重庆涪陵制药厂有限公司，批号13010006。

1.3 主要试剂与仪器

10%水合氯醛，中国医药集团上海化学试剂公司；链脲佐菌素（STZ），美国Sigma公司；血清胰岛素检测试剂盒，上海麦约尔生物技术有限公司；SYBR Green，瑞士罗氏公司；Rnase-free水，北京百泰克生物科技有限公司；高纯总RNA快速提取试剂盒、荧光实时定量PCR试剂盒及反转录试剂盒，中国宝生物工程（大连）有限公司；引物合成：大鼠PI-3K、GLUT4及β-actin基因特异性引物序列由中国宝生物工程（大连）有限公司设计并合成。稳豪倍优型血糖仪，强生（中国）医疗器材有限公司；酶联免疫检测仪，美国BD公司；C1000型PCR仪、CXF96型RT-荧光PCR仪，美国伯乐公司。

2 实验方法

2.1 分组与造模

实验大鼠普通饲料适应性饲养1周，禁食、禁水12 h后尾部针刺采血，测定空腹血糖（FBG），血糖正常大鼠入选。将60只大鼠按体质量标号后，随机抽出12只为空白组，继续普通饲料饲养；余下48只造模组均喂以高脂饲料 （猪油10%，胆固醇2%，胆酸盐0.5%，蔗糖20%，普通饲料67.5%）[4-5]。SPF级实验室喂养，自由饮水。4周后，造模组大鼠平均体质量增加20%，可确定建模成功；成模大鼠隔夜禁食12 h，期间不禁水，将STZ现溶于pH4.4柠檬酸-柠檬酸三纳缓冲液中，按30 mg/kg腹腔注射 [6-7]，连续3 d，建立T2DM大鼠模型。禁食、不禁水12 h，尾静脉采血，测大鼠尾静脉FBG；50%葡萄糖溶液2.5 g/kg灌胃，行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），测餐后2 h血糖（2 h PG），取FBG≥11.0 mmol/L、2 h PG≥16.7 mmol/L大鼠归入模型组[8]，未达标者均剔除。造模成功后，各组大鼠分笼，每笼3～4只，予因糖尿病大鼠饮水量增加，防止其水量不足，给予双路喂水。将成模大鼠按随机数字表法分为化浊颗粒组、罗格列酮组、模型组。除空白组给予普通饲料外，其余组均给予高脂饲料。

2.2 给药

按人与大鼠的体表面积之比换算成人所用药量：化浊颗粒组每日予化浊颗粒混悬液2.025 g/kg灌胃，罗格列酮组每日予罗格列酮混悬液0.36 mg/kg灌胃，灌胃体积1 mL/kg，空白组、模型组每日给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续10周。

2.3 一般情况观察

观察大鼠的一般状态、自主活动、精神状态、体毛、色泽、饮水量、小便等。

2.4 体质量及摄食量测定

实验前，电子天平测定大鼠体质量，开始予高脂饲料喂养后，每周于同一时间段称重1次，观察大鼠生长、体质量情况，依体质量变化随时调整灌胃量，至灌胃10周，最后1次给药后禁食12 h，再对每只大鼠进行称重并记录在摄食相似的情况下体质量的变化。

2.5 血糖测定

实验前全部大鼠隔夜禁食、禁水12 h后，尾部取血，测血糖1次。实验组予高脂饲料后，每周同一时间测大鼠血糖1次，直至灌胃结束。记录高脂饮食及药物灌胃后，各组大鼠血糖变化情况。

2.6 标本采集和处理

药物干预10周后，最后1次灌胃并禁食12 h后称重，检测大鼠尾静脉FBG、OGTT 2 h PG，OGTT结束后，所有大鼠均禁食12 h，10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，取血，测血清空腹胰岛素（FINS）。并任取一侧后肢骨骼肌，装入冻存管，迅速冻存于液氮中，24 h后置于-80 ℃低温冰箱保存，备用。

2.7 RT-PCR检测大鼠骨骼肌组织磷脂酰肌醇3激酶、葡萄糖转运蛋白4基因表达

2.7.1 骨骼肌总RNA的提取 取超低温冻结骨骼肌组织约5 mg，加入200 ?L Trizol，剪碎组织，再加约1000 ?L Trizol，加入液氮，充分匀浆，静置后离心，加入氯仿，吸取上清液，将其移入新的EP管中，加入氯仿约240 ?L，冰上静置5 min， 4 ℃、12 000 r/min离心15 min；吸取无色上清液（含RNA）约400 ?L，移至新的无RNase EP管中，加入600 ?L异丙醇，充分混匀，冰上静置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入75%乙醇1 mL，上下颠倒充分洗管壁，弃上清液，室温下干燥沉淀约5 min。最后向EP管中加入50 ?L RNase-free水溶解，即为提取的总RNA液体，置于-80 ℃冰箱存储，备用。

2.7.2 总RNA浓度及纯度测定 用超微量分光光度计检测并确定总RNA的纯度与浓度，用A260/A280比值来判断RNA纯度，A（μg/mL）=A260×B×40 μg/mL。（A为总RNA浓度，B为稀释的倍数）取2 μL用于RNA浓度及纯度鉴定，100 μL Rnase Free dH2O调零，2 μL总RNA加入98 μLRnase Free dH2O中，分别在260 nm（RNA）和280 nm（PRO）波长处测OD值，用两者比值衡量样本纯度，所提取样本纯度应当在1.8～2.0之间。

2.7.3 总RNA反转录 反应体系为20 ?L，总RNA量为100 ng，建立反转录反应体系。试剂确定为5×PrimeScript RT Master Mix、总RNA、Rnase Free dH2O，加入量分别为4、4、12 ?L，反转录反应条件为37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，冷却至4 ℃。然后混匀并离心，进行反转录反应为cDNA。

2.7.4 RT-PCR检测各组目标基因表达水平 取反转录完成的cDNA，专用SYBR Green荧光染料， RNase-free灭菌水和目的基因引物，引物序列如下：β-actin上游引物5'-AATTACTCCCTCTCCTA-3'，下游引物5'-ACTCATCTACTCCTCTTCT-3'；PI-3K上游引物5'-ACTCCTAAGCCATTAAA-3'，下游引物5'-ATCCAATA CTTTA-3；GLUT4上游引物5'-TTGCAGTGCCTGAGTC TTCTT-3'，下游引物5'-ATCACTTTCTGTGGGGCGTT-3'。应用CFX96 RT-PCR扩增仪，其反应总体系为25 ?L，采用试剂SYBR荧光染料、Forward、Reverse、DNA、无RNA酶灭菌蒸馏水，按顺序加入EP管中，用量分别为6.25、0.5、0.5、1、4.25 ?L，最终浓度SYBR荧光染料为1（对比浓度）、Forward为0.4 ?mol/L×1、Reverse为0.4 ?mol/L×1。低速离心机离心后，放入RT-PCR仪中进行扩增，40个循环完成后，出现对应的RT-PCR扩增曲线与溶解曲线，进行PCR半定量分析。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，计量资料组间比较采用独立样本t检验，给药前后比较采用配对t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般情况

空白组大鼠精神状态良好，活动灵敏，其体表皮毛光滑，且有光泽，食欲正常，尿量未见明显增减；模型组皮毛有发黄的趋势、较粗糙，毛色失去光泽，喜卧少动，饮水量和尿量均增加；进入实验后期，模型组大鼠精神最差，出现不同程度的萎靡，反应迟钝，无力、呈躺卧状态，皮毛粗糙明显，毛色发黄。与模型组比较，化浊颗粒组、罗格列酮组均有不同程度的改善。

4.2 大鼠体质量变化

空白组大鼠体质量未见减轻，呈稳定持续上升状态。模型组、化浊颗粒组、罗格列酮组实验早期均有不同程度的体质量增加；第5周开始，STZ造模后，各组体质量开始下降；给药10周后，罗格列酮组大鼠体质量与模型组比较增加，但化浊颗粒组大鼠体质量仍缓慢下降（P<0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠给药前后体质量比较（—x±s，g）

组别 只数 给药前 给药后

空白组 12 253.5±25.50 418.9±18.90

模型组 12 247.7±22.83 320.8±18.12

化浊颗粒组 12 250.7±24.53 289.8±15.55#

罗格列酮组 12 248.6±19.85 368.1±17.29

注：与模型组比较，#P<0.05

4.3 化浊颗粒对大鼠空腹血糖的影响

各组大鼠灌胃治疗10周后，模型组FBG较给药前未见明显差异，但化浊颗粒组及罗格列酮组FBG较给药前明显降低（P<0.05）；化浊颗粒组和罗格列酮组FBG与模型组比较均有降低（P<0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠给药前后FBG水平比较（—x±s，mmol/L）

组别 只数 给药前 给药后

空白组 12 4.52±0.48 4.48±0.51

模型组 12 21.54±2.88 26.47±1.23

化浊颗粒组 12 22.68±3.42 13.36±1.01#★

罗格列酮组 12 22.45±3.67 12.67±0.87#★

注：与模型组比较，#P<0.05；与本组给药前比较，★P<0.05（下同）

4.4 化浊颗粒对大鼠餐后2 h血糖的影响

各组大鼠给药10周后，模型组OGTT 2 h PG与给药前比较未见明显差异，但化浊颗粒组及罗格列酮组OGTT 2 h PG与给药前比较明显降低（P<0.05）；给药后，模型组OGTT 2 h PG高于空白组（P<0.05）；化浊颗粒组及罗格列酮组与模型组比较，OGTT 2 h PG水平均有所降低（P<0.05），罗格列酮组优于化浊颗粒组（P<0.05）。结果见表3。

表3 各组大鼠给药前后OGTT 2 h PG水平比较（—x±s，mmol/L）

组别 只数 给药前 给药后

空白组 12 4.63±0.46 6.94±0.62

模型组 12 21.54±2.88 25.98±3.25

化浊颗粒组 12 22.68±3.42 16.51±1.09★#

罗格列酮组 12 22.45±3.67 12.85±0.67★#*

注：与化浊颗粒组比較，*P<0.05

4.5 化浊颗粒对大鼠空腹血清胰岛素的影响

模型组、化浊颗粒组和罗格列酮组给药前与空白组比较FINS水平较高；给药10周后，化浊颗粒组、罗格列酮组与给药前比较，血清FINS水平有所下降（P<0.05），给药后与模型组比较也有下降（P<0.05）。结果见表4。

表4 各组大鼠给药前后血清FINS水平比较（—x±s，mU/L）

组别 只数 给药前 给药后

空白组 12 15.51±1.89 15.82±1.62

模型组 12 25.62±2.81 25.40±2.26

化浊颗粒组 12 25.81±3.24 19.38±3.25★#

罗格列酮组 12 25.90±2.89 19.16±4.75★#

4.6 化浊颗粒对大鼠磷脂酰肌醇3激酶、葡萄糖转运蛋白4基因表达的影响

化浊颗粒组和罗格列酮组骨骼肌组织PI-3K及GLUT4 mRNA表达与模型组比较有所增加（P<0.05），模型组较空白组PI-3K、GLUT4 mRNA表达水平呈低表达（P<0.05）。结果见表5。

表5 各组大鼠骨骼肌PI-3K和GLUT4 mRNA表达比较（—x±s，2-ΔΔCt）

组别 只数 PI-3K mRNA GLUT4 mRNA

空白组 12 1 1

模型组 12 0.96±0.06 0.62±0.07

化浊颗粒组 12 1.10±0.10# 0.77±0.12#

罗格列酮组 12 1.17±0.24# 0.97±0.10#

5 讨论

IR是指胰岛素执行其正常生物作用的效应不足，表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖的利用障碍。IR普遍存在于T2DM中，是T2DM的主要发病因素之一。

PI-3K途徑是胰岛素信号转导的主要通路之一。研究表明，胰岛素刺激包括脂肪和骨骼肌在内的靶组织摄取利用葡萄糖是通过胰岛素受体（InsR）/胰岛素受体底物-1（IRS-1）/PI-3K/GLUT4等一系列信号转导过程完成的[9]。在PI-3K途径中，当胰岛素与靶细胞表面InsR结合，InsR即发生磷酸化并激活内在的酪氨酸激酶，导致IRS-1等酪氨酸残基磷酸化，并与PI-3K的p85调节亚单位结合，催化P110而激活PI-3K，活化的PI-3K可加速GLUT4从胞内易位至胞膜，调节肌细胞、脂肪细胞和肝细胞对葡萄糖的摄取利用。这一信号转导过程的任何环节障碍均可引起IR。模型组大鼠FBG、2 h PG、FINS均升高，提示本实验所用动物模型基本符合T2DM的特征和要求。药物干预后，化浊颗粒能降低大鼠FBG、2 h PG及FINS水平，说明该药能有效改善T2DM大鼠的糖耐量异常，提高胰岛素的敏感性。化浊颗粒组与罗格列酮组骨骼肌组织PI-3K及GLUT4 mRNA表达水平均较模型组显著增加（P<0.05）。模型组PI-3K及GLUT4 mRNA表达水平较空白组呈低表达（P<0.05）。提示化浊颗粒提高胰岛素敏感性的作用，与激活骨骼肌组织胰岛素信号传导通路中PI-3K和GLUT4的mRNA表达有关。另外，PI-3K和GLUT4活性在胰岛素信号转导过程中也起着重要的作用，化浊颗粒是否也通过增加其活性来改善IR，还有待今后进一步研究。

参考文献：

[1] 陈家伦.临床内分泌学[M].上海：上海科学技术出版社，2011：1250.

[2] 康学东，余臣祖，朱瑾，等.化浊颗粒对非酒精性脂肪肝大鼠血脂代谢的影响[J].中医杂志，2011，52（24）：2125-2127.

[3] 康学东，余臣祖，朱瑾，等.化浊颗粒治疗大鼠非酒精性脂肪肝的研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（18）：200-202.

[4] Leng S， Lu FE， Xu L. Therapeutic effects of berberine in impaired glucose tolerance rats and its influence on insulin secretion[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2004，25（4）：496-502.

[5] 向雪松.2型糖尿病大鼠模型的建立及其在辅助降血糖功能评价中的应用[D].北京：中国疾病预防控制中心，2010.

[6] Srinivasan K， Viswanad B， Asrat L， et al. Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat：a model for type 2 diabetes and pharmacological screening[J]. Pharmacological Research，2005，52（4）：313-320.

[7] 金苗苗，母义明，牛晓红.高脂喂养联合低剂量链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型建立及其代谢特征分析[J].长治医学院学报，2012，19（3）：167-170.

[8] 柳红芳，陆菊明，母义明，等.n-3多不饱和脂肪酸对高脂诱导胰岛素抵抗大鼠肝脏和骨骼肌胰岛素受体及葡萄糖转运子的作用[J].中华糖尿病杂志，2005，13（3）：192-195.

[9] 艾碧琛，肖漫江，喻嵘，等.降糖益肾方对MKR鼠2型糖尿病肾病早期的保护作用[J].中国中医药信息杂志，2010，17（3）：29-30，33.

（收稿日期：2014-10-30）

（修回日期：2014-11-22；编辑：华强）