高效纤维素降解真菌的分离鉴定

宋艳雨 等

摘要：经过刚果红染色法初筛和秸秆失重率测定复筛从腐烂的树木样品中分离到一株高效纤维素降解菌CBSX2。根据其形态学及遗传分析鉴定CBSX2菌株为链格孢属（Alternaria ochroleuca）。关于链格孢菌属的纤维素分解菌的研究相对较少，CBSX2鉴定为纤维素的生物降解提供了新的菌种资源。

关键词：纤维素 真菌 鉴定 链格孢属

在自然领域，纤维素是贮存数量最多、分布范围最广的能够再生的天然碳水化合物，其大多分布在木头、秸秆等物质的细胞壁中，每一年利用光合作用能够产生纤维素将近十亿吨。但是纤维素很难分化，以致其的应用有很大的制约性。长时间以来，纤维素的分化大多是酸水解，在十九世纪的二十年代，人们就知道了酸水解能够用来制造糖浆，运用到工业的各个领域。酸水解包括两种方式，一种是稀酸水解，另外一种是浓酸水解。前者的运用环境是较高的压力与较高的气温，水解反应的时长区间为几秒至几分钟，较多运用到连续生产过程中；后者则与其相反，其的运用环境是较小的压力与较低的气温，和前者比较，其的水解反应时长更长。在酸水解时会有主要要素影响单糖的得率，重点包含气温、压力、生物物质颗粒的体积、酸浓度、液态与固态的比重等。在酸水解时，木糖非常迅速的分化为糠醛，葡萄糖分化为羟甲醇糠醛，部分抑制因子因此形成，导致了糖源的无谓浪费，并且限制了乙醇的发酵过程，所以，酸水解纤维素工业依旧需要持续的健全。

当前的探究大部分集聚在数量不多的菌株上，譬如里氏木霉等。但是此菌株依旧存有产酶费用高、酶活性不稳固、作用PH范畴较窄等不足。所以寻求更多、更有效、影响范畴更大的新菌种是特别重要的。

本文从腐烂树木中分离到几株高效降解纤维素的微生物菌株，其中菌株CBSX2纤维素降解能力最强，鉴定CBSX2菌株为链格孢属（Alternaria ochroleuca）。我国及其他国家针对链格孢菌属的纤维素酶的探究寥寥无几，为纤维素的分化提供了全新的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

样品采自长白山野生腐烂树木，装入自封袋，4℃保存。

1.2 培养基

升级之后的刚果红平板培养基：（NH4）2SO4 2g，MgSO4 0.5g，K2HPO4 1g，NaCl 0.5g，纤维素粉2g，刚果红0.4g，琼脂20g，纯净水1000mL，自然pH值。

1.3 实验方法

1.3.1 纤维素降解作用真菌的分离

1.3.1.1 具备纤维素分解性能的菌株的初次选择

能够分解纤维素的微生物类型众多，学者们探究较多的是细菌与真菌，可是因为前者形成的纤维素酶大部分是胞内酶，因此后者变为学者们探究的焦点，在探究过程中，纤维素酶的检测方式特别繁杂，而运用平板菌落选择能够大致判定纤维素酶的活动，进而降低試验的工作数量，经过升级以后的平板培养基，其中，纤维素粉以每升0.1mol的浓度盐酸处置二十四小时以后，水洗到酸碱值为中性，之后过滤，让其干燥。经流水冲洗二十四小时以后烘干，不但菌落发育优良，大小合适，并且红色水解圈边缘清楚，大小清晰，效果十分理想。

称取10g样品到90ml无菌水中，在摇床中震荡30min。然后静置吸取1ml上清液到9ml无菌水中，以此一直稀释到102，103，104，105浓度，吸取0.1ml涂布于刚果红纤维素琼脂平板上，在28℃恒温培养箱中培养2到7天，筛选出在平板上发育较为迅速的红色的浓度较大的透明水解圈的菌落，且测量其水解圈的体积实施划线分隔，认定是比较单纯的单菌落以后，栽种到保藏培养基上储存。

1.3.1.2 根据秸秆失重率进行复筛

①将5毫升菌液接种到50毫升复筛培养基中，常温28摄氏度震荡培养，驯化三到四次，分解时间逐步减少，来提升菌株对天然纤维素的分解水平。

②把1毫升菌液接种到50毫升复筛培养基中，常温28摄氏度震荡培养，分别在0天，第4天，第8天，第12天，第16天的时候测验其秸秆重量的变化状况，记录秸秆的失重水平，从中筛选出失重水平高的菌株作为复筛菌株。

秸秆失重率核算方式：把上文提到的五个时间的培养物，用无菌的水清洗，使用两百目的尼龙网过滤，反复冲洗，之后沥干水分，到105°烤箱进行烘干。

1.3.2 具有纤维素分解作用的真菌的鉴别

1.3.2.1 形态学观察

对已经分离的纤维素分解真菌的类型鉴别依据宏观的培养形状菌落特点，微观层面的个体外形特点和部分生物层面的特点加以表述与经典类型划分鉴别。把菌接种在固态培养基上，采用点植的方法进行接种，也就是以接种针选取少些的菌丝点植在平板的核心的地方，之后在28度的气温下培养一些天数，进行观察，查看菌落特点。分别从菌落的边际与核心位置选择少些的菌丝，放到显微镜的下面，进行普通的显微镜检验。

1.3.2.2 菌种的分子鉴别

运用CTAB法对选出的有催芽成效的真菌实施基因组DNA的选择，而且用使用概率较高的物质ITS4和ITS5实施基因的增加与秩序的测量。

ITS4 5TCCTCCGCTTATTGATATGC 3

ITS5 5GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3

PCR反应机制是50μL，PCR buffering（Mg2+）加1/10，dNTPs各200μM，引物各0.2μM，taqDNA聚合酶 1-2.5U，模板100ng，无菌双蒸水补足。反应要求是 94度预变性10分钟， 94度变性45秒， 55度退火45秒， 72度延伸2分钟，共计三十五个循环，72度延伸10分钟，将回收后的PCR产物送往测序公司进行测序，得到的序列以blast搜索为基础，选择和探究菌株次序最为类似的种亦或最相似的进化分支代表菌株的序列加以比较，使用Mega6.0工具通过ML算法，利用bootstrap 1000次建树结果建立进化树。

2 结果与分析

2.1 具有纤维素分解能力的真菌筛选

2.1.1 具有纤维素分解能力的菌株的初筛

从采集的样品中在初筛刚果红培养基上有透明圈的菌株有5株，分别命名为CBSX1，CBSX2，CBSX3，CBSX4，CBSX5

表1 初筛菌株在刚果红平板上水解圈大小

[编号＼&水解圈直径（cm）＼&菌落直径（cm）＼&比值＼&CBSX1

CBSX2

CBSX3

CBSX4

CBSX5＼&4.38

11.5

3.96

8.96

5.2＼&4.23

4.5

2.12

6.32

4.56＼&1.035

2.56

1.87

1.42

1.14＼&]

2.1.2 具有纤维素分解能力的菌株的复筛结果

通过测定初筛菌株的秸秆降解率，进一步通过对秸秆降解效果的测定，复筛出对纤维素降解最好的菌株，未接种纤维素降解菌的CK其降解率仅为10%，CBSX2表现出的效果最好达到了23%。

2.2 具有纤维素分解作用的真菌的鉴定

2.2.1 形态学鉴定结果

筛选出的高效纤维素降解真菌CBSX2菌落形态为灰色绒毛状，质地紧致，在PDA上涨势很快。边际整齐，表现出波浪形状或者裂片形状，在培养基的层面能够见到有黑颜色的孢子堆出现。发育完成的分生孢子包括4到8个横膈膜，1到5个总隔膜，呈现出卵形、椭圆形等等，没有发育成熟的孢子是没有颜色的，发育成熟以后变为黑色。

2.2.2 菌种分子鉴定结果

本文以ITS4和ITS5为引物，对从样品中分离的真菌菌株进行了扩增，并对扩增产物进行了测序。依托blast搜索，选择和探究菌株次序最相近的种亦或最相似的进化分支代表菌株的序列加以比较，使用Mega6.0工具通过ML算法，利用bootstrap 1000次建树结果建立进化树。结果表明CBSX2真菌与链格孢属（Alternaria ochroleuca）的同源相似性达到99%，氨基酸序列的相似性也达到了92%。

3 讨论

当前，瑞氏木霉是全球探究与运用最多的纤维素工业微生物。美国的能源署提供了1000万美金的帮助，在瑞氏木霉的纤维素生产开发方面获得了显著的探究成果，申请了很多项专利。中国在此方面的开发是大幅度滞后于全球领先水平的，因此在将来瑞氏木霉的纤维素生产开发过程中，极有可能遇到技术壁垒。

国内外关于链格孢菌属的纤维素酶的研究较少，又为其的应用方向增添了一笔。为纤维素的分解提供了全新的菌种类型，为得到自主知识产权的纤维素分解提供了条件。

本文虽然确定了纤维素降解的能力，但其作用机理并未深入研究，是否产生较为完整的纤维素酶系和种类还有待进一步研究。

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