HPLC法测定藏药仁青芒觉胶囊中西红花苷－I和西红花苷－Ⅱ的含量

杨博涵朱旭江

1.天津市医药科学研究所，天津 300020；2.甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730070

HPLC法测定藏药仁青芒觉胶囊中西红花苷－I和西红花苷－Ⅱ的含量

杨博涵1朱旭江2*

1.天津市医药科学研究所，天津 300020；2.甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730070

目的：建立仁青芒觉胶囊中西红花的含量测定方法。方法：采用HPLC法，用光电二极管阵列检测器 （DAD），流动相为甲醇－水（50∶50），流速1.0 ml／min，检测波长440nm，柱温25℃，对西红花苷－Ⅰ、西红花苷－Ⅱ进行定量测定。结果：西红花苷－Ⅰ在0.0336～0.4987μg范围内呈良好的线性关系，r＝0.9999，加样回收率为97.43%，RSD＝2.18%；西红花苷－Ⅱ在0.0129～0.1818μg范围内呈良好的线性关系，r＝0.9998，加样回收率为99.75%，RSD＝1.53%结论：该方法操作简便、专属性、重现性好，可有效地控制仁青芒觉胶囊的质量。

仁青芒觉胶囊；HPLC；西红花苷－Ⅰ；西红花苷－Ⅱ

仁青芒觉始载于 《盘德琼乃》，是藏族验方。仁青芒觉胶囊由毛诃子、蒲桃、西红花、木香、丁香、朱砂、马钱子等药材组成的复方制剂，具有清热解毒，益肝养胃，明目醒神，愈疮，滋补强身的功效。其现行标准为国家食品药品监督管理局标准（YBZ07062005－2010Z），含量测定项为检查没食子酸的含量，但处方中多味药材含有没食子酸，故该法的专属性不强。仁青芒觉胶囊处方组成比较复杂，含量测定存在一定难度，导致该药含量测定研究报道较少［1－3］。处方中的西红花为鸢尾科植物番红花 （Crocus sativus L.）的干燥柱头，系贵重药材，具有活血化瘀，清热解毒，解郁安神的作用，且仁青芒觉胶囊为保密处方，处方量不明确。为了保证用药的有效性，试验采用高效液相色谱法建立了仁青芒觉胶囊中西红花苷－I和西红花苷－Ⅱ的含量测定方法，该法操作简便、结果准确，可用于产品内在质量的控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪（Waters 2998 DAD检测器，Empower色谱工作站，美国Waters公司）；Mettler AE 240电子天平（瑞士梅特勒）；Sartorius R200D电子天平（德国赛多利斯公司）；KH－500DE超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；HGC－24A氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）。

1.2 试药 西红花苷－I（批号：111588－200501）和西红花苷－Ⅱ（批号：110589－201304，含量92.4%）均购自中国食品药品检定研究院；仁青芒觉胶囊 （批号：100501、120001、130101）由甘肃省某藏药企业提供。甲醇 （色谱纯，德国默克Merck公司）；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：资生堂CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250mm，5μm），Waters Symmetry C18（4.6mm× 250mm，5μm），Thermo scientific BDS HYPERSIL C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇－水（50：50）；流速：1ml／min；柱温：25℃；检测波长：440nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取西红花苷－Ⅰ对照品8.28mg，至50ml棕色量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，作为西红花苷－Ⅰ对照品储备液。精密称取西红花苷－Ⅱ对照品8.20mg，至50ml棕色量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，作为西红花苷－Ⅱ对照品储备液。分别精密吸取西红花苷－Ⅰ对照品储备液5ml和西红花苷－Ⅱ对照品储备液2ml至50ml容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，制成混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加稀乙醇适量，置冰浴中超声处理 （功率200 W，频率60KHz）30min，放至室温，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性供试品的制备 按照供试品溶液的制备方法，分别制备缺西红花的阴性供试品溶液。

2.2.4 样品的测定 按“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液各5～10μl，注入液相色谱仪，测得液相色谱图，结果见图1。结果表明，西红花苷－Ⅰ、西红花苷－Ⅱ色谱分离良好，且阴性对测定结果无干扰。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系的考察 取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项的色谱条件，分别进样2、4、8、10、14、18、22、26、30μl，测定西红花苷－Ⅰ、西红花苷－Ⅱ的峰面积，以进样对照品质量 （μg）为横坐标 （X），峰面积为纵坐标 （Y），绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。结果表明，西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ在线性范围内呈良好的线性关系。

图1 高效液相色谱图

表1 西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的线性回归方程

2.3.2 精密度实验 精密吸取同一份供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积积分值，西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ的RSD分别为0.5%和0.4%，结果表明进样精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：130001）分别在0、2、4、6、8、24 h，按“2.1”项的色谱条件各进样1次，记录峰面积积分值，西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ的RSD分别为1.4和1.3%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.3.4 重复性试验 取同一批供试品（批号：130001）6份，按“2.2.2”项下方法处理，“2.1”项的色谱条件测定含量。结果西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ的RSD分别为0.98%和1.02%。

2.3.5 加样回收率 精密量取西红花苷－Ⅰ对照品储备液（0.1656mg／ml）1.5、2.0、2.5ml各3份和西红花苷－Ⅱ对照品储备液（0.06061mg／ml）0.8、1.0、1.2ml各3份，置50ml棕色量瓶中，溶剂采用氮吹仪吹干，再分别精密称取已知含量同一批号（批号：130001，西红花苷－Ⅰ含量1.2605 mg／g；西红花苷－Ⅱ含量0.4376 mg／g）的供试品9份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ的回收率。结果见表2、表3。

表2 西红花苷－Ⅰ加样回收率

表3 西红花苷－Ⅱ加样回收率

2.4 样品测定结果 按供试品溶液的制备方法和测定方法，对样品进行制备和测定，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按“2.1”项下色谱条件进样分析，按外标法以峰面积计算样品中西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ含量，测定3批供试品的含量，结果见表4。

表4 仁青芒觉胶囊含量测定结果

3 讨论

3.1 提取方法的选择 参考中国药典［4］及有关文献［5－6］，提取溶剂选定为稀乙醇。西红花苷文献报道较多［7－8］，大多采用超声提取方法。西红花苷为水溶性类胡萝卜素类成分，分子中具有多个共轭双键，导致其稳定性差，且对温度非常敏感［9］。研究对供试品在冰浴中和常温下超声处理方法进行了对比研究。结果表明，冰浴比常温提取所测得的西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ峰面积略高，故采用冰浴超声提取作为仁青芒觉胶囊中西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ的提取方法。

3.2 超声时间的选择 根据预实验的结果，供试品制备采用冰浴中分别超声（功率200 W，频率60 KHz）20、25、30、40、50 min，依法测定峰面积，结果表明，超声提取30 min时的测定值略高，故选择提取时间为30 min。

3.3 测定波长的选择 对西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ进行全波长扫描，结果在440 nm波长处有最大吸收，故选择440nm作为测定波长。

3.4 方法适用性试验 取同一批样品按供试品溶液的制备方法进行制备，分别采用三种品牌的色谱柱测定，西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ测得含量的RSD分别为1.92%和1.56%，结果无明显差别，说明该方法适用性较好。

3.5 小结 样品各批次间西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ的含量差异较大，说明现行的质量标准不能控制产品质量，使各批样品的投料量存在差异。实验采用HPLC法同时测定仁青芒觉胶囊中西红花苷－Ⅰ和西红花苷－Ⅱ的含量，此法方便可靠、重现性好，为仁青芒觉胶囊的质量控制与评价提供了参考资料。

［1］田薇，陈朝晖.薄层色谱法检查仁青芒觉胶囊中乌头碱、士的宁的限量［C］.甘肃省化学会成立六十周年学术报告会暨二十三届年会论文集，2003，419.

［2］马宁，朱旭江，杨锡，等.仁青芒觉胶囊质量标准研究 ［J］.中国中医药信息杂志，2014，21（6）：72－75.

［3］房少新，赵利平.藏药仁青芒觉中微量元素的测定 ［J］.光谱实验室，2013，30（2）：916－919.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典 （一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［5］周素娣，仲惠娟.HPLC测定西红花提取物及其片剂中各西红花苷含量［J］.药物分析杂志，1998，18（3）：159－162.

［6］李彬，周素娣，周锦祥.中药西红花指纹图谱研究 ［J］.海峡药学，2005，17（3）：83－85.

［7］尼珍，阿萍，格桑索朗.HPLC法测定藏药二十五味珍珠丸中西红花苷Ⅰ的含量［J］.药物分析杂志，2011，31（1）：151－153.

［8］缪玉山，黄根林，倪冲，等.反相高效液相色谱法对不同来源西红花药材中西红花苷－1、苷－2的定量分析［J］.中国药学杂志，2002，22（11）：654－656.

［9］付小梅，王峥涛.西红花苷－Ⅰ的稳定性研究［J］.食品科学，2012，33（5）：71－73.：

HPLC determ ination of crocin－Ⅰand crocin－Ⅱin Renqing M angjue capsules

YANG Bohan1ZHU Xujiang*
1.Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China；2.Gansu Institute for Drug Control，Lanzhou 730070，China

Objective To set up the quality standard of Renqing Mangjue capsules.M ethods The content of crocin－Ⅰand crocin－Ⅱwere determined by HPLC，which conducted with a DAD detector and the detection wavelength set at440nm.The column was C18（4.6mm×250mm，5μm）withmobile phase consisted ofmethanol－water（50：55）and the flow rate was 1.0 ml·min－1. The column temperaturemaintained at 25℃.Results HPLC determined that crocin－Ⅰwas in range from 0.0336 to 0.4987μg，which presented a good linear relationship（r＝0.9999）.The average recovery was 97.43%，RSD was 2.18%.HPLC determined that crocin－Ⅱwas in range from 0.0129 to 0.1818μg，which presented a good linear relationship（r＝0.9998）.The average recovery was 99.75%，RSD was1.53%.Conclusion Themethod is simple in operation.The results are accurate，reliable and good in reproducibility.Themethod can effectively control the quality of Renqing Mangjue capsules.

Renqing Mangjue capsules；HPLC；crocin－Ⅰ；crocin－Ⅱ

R284.1

A

1007－8517（2015）20－0016－03

2015.07.10）

杨博涵，女，学士。E－mail：1132563453＠qq.com

朱旭江，博士，主任药师。主要从事药品质量标准研究、色谱学及相关技术。E－mail：gszhuxujiang＠163.com