泰山螭霖鱼全人工催产繁殖技术初步研究

林贞贤，甘庆萌，张聪

(泰山学院生物与酿酒工程学院，山东泰安271000)

泰山螭霖鱼全人工催产繁殖技术初步研究

林贞贤，甘庆萌，张聪

(泰山学院生物与酿酒工程学院，山东泰安271000)

本研究以不同种类及剂量的催产药物对泰山螭霖鱼进行注射催产，并测定了催产前后亲鱼体内GtH水平的变化.结果表明:以人体绒毛膜促性腺激素(HCG)25IU+促黄体释放激素类似物A2(LHRHA2)0.4μg+地欧酮(DOM)0.2mg的催产组效果最佳，其效应时间12h左右，催产率为66.7%，且与对照组差异显著，后经人工挤卵、授精，并成功孵化出了仔鱼;催产效果与催产时机(亲鱼的性腺成熟度)相关;催产药物可提高雌雄亲鱼体内促性腺激素(GtH)的水平.

泰山螭霖鱼;人工催产;促性腺激素(GtH)

泰山螭霖鱼(Varicorhinus°macrolepis Bleeker)学名多鳞白甲鱼，俗称赤鳞鱼，隶属鲤科、鲃亚科、白甲鱼属，是一种为泰山所独有的小型野生鱼类，是泰安市首个获得国家地理标志保护的产品，其人工开发利用前景广阔［1－2］.

目前，经泰安市水产养殖专家多年的努力，泰山螭霖鱼的人工繁殖已取得成功，主要包括亲鱼培育、组群、制造人工产盆、收卵、孵化等环节［3］.整套繁殖技术相对原始落后，加之螭霖鱼属分批产卵的类型，自然状态下无法实现集约化、规模化育苗.人工催产可以使雌鱼集中产卵，便于受精卵的孵化与仔鱼的培育.现如今，许多之前繁殖困难的商品鱼，如黄颡鱼［4］，泥鳅［5］等都实现了人工催产和规模化繁殖.然而，目前，螭霖鱼在人工催产方面还没有一套成熟的技术，虽然有刘传忠［6］、刘永进［7］、朱桂玉［8］等人先后对泰山螭霖鱼的人工催产技术进行了初步研究，但其催产效果仍待进一步验证和优化，全人工繁殖技术更是尚未见报道.本项目组成员于2015年4月至5月对螭霖鱼进行了人工催产、挤卵、授精、孵化等繁殖技术的初步研究，并测定了注射催产激素前后雌雄亲鱼体内促性腺激素(GtH)的水平，本研究的开展旨在为螭霖鱼规模化、集约化苗种繁育提供理论和技术支持.

1 材料与方法

1.1 亲鱼培育

选择体质健壮、性情活泼、无病、无伤的4冬龄螭霖鱼(雌雄各半，雌鱼体重50g左右，雄鱼体重35g左右)作为亲鱼，6－12尾亲鱼投放在循环水族箱(100×80×40cm)中进行强化培育，整个繁殖期间水族箱水温控制在18－21℃.亲鱼每天投喂升索牌渔用饲料(S8)2次，投喂量为其体重的0.5%－1%.每天对水族箱中的水质、水温及亲鱼的吃食情况进行观察记录，并对水族箱进行吸污和换水，换水量为总水体的1/5左右.

1.2 人工催产

在四月下旬时，我们观察到雄鱼对雌鱼追逐增强并不时撞击雌鱼腹部，捞起雄鱼并轻挤腹部即有浓稠且呈乳白色的精液流出，入水即散.雌鱼腹部膨大柔软，卵巢轮廓明显.我们于4月22日，随机选取雌鱼20尾进行了第一次批次的催产实验，催产药物为HCG 60IU/尾.第二批次于5月1日进行，随机选取雌鱼12尾，分成四个繁殖组，每组均为雌鱼3尾，各组剂量分别为HCG50 IU/尾、HCG40IU/尾、HCG60 IU/尾和HCG75IU/尾.于5月9日进行第三批次实验，随机选取雌鱼15尾，分成三个繁殖组，第各组催产剂种类和剂量分别为HCG50IU/尾、LHRH－A20.5μg+DOM0.2mg/尾、HCG50IU+LHRH－A20.5μg +DOM0.2mg/尾.于5月13日进行了第四批次催产:精选成熟度高的雌鱼6尾，催产剂种类和剂量为HCG25IU+LHRH－A20.4μg+DOM0.2mg/尾.四个批次均设置对照组(雌鱼10尾).注射催产药物剂量在0.15ml－0.25ml，所用绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素释放激素类似物A2(LHRH－A2)和地欧酮(DOM)，均为宁波市三生药业有限公司出品.

注射和尾静脉采血均使用lmL注射器配5.5号静脉输液针.注射方法为:将亲鱼捞出并用干净的纱布裹住，一人固定鱼的头部与尾部，一人手持针头在胸鳍基部无鳞处的凹入部位，将针头朝鱼体前方与体表成45°角刺入约1cm，后将注射液缓缓注入鱼体内.

1.3 人工授精

催产注射12h后，对实验中的处理组和对照组均尝试进行人工挤卵.催产组若有饱满游离的卵粒流出，则计为催产成功，若没有卵子流出，则亲鱼放回继续培育，12h经2次尝试挤卵，仍无卵粒流出，则为催产失败.人工挤卵的具体操作如下:捞取雌鱼，用干爽的纱布将鱼身包住，擦干其腹部及泄殖孔，使鱼尾斜向下，一手固定鱼的头部，一手轻轻地由上而下挤压雌鱼腹部，若有鱼卵流出，则落入洁净干燥的搪瓷托盘中.挤出鱼卵后立即捞取一尾雄鱼，用同样的方法，将精液挤压至鱼卵上，为保险起见，再捞一尾雄鱼，将精液挤入鱼卵上.用毛笔将精卵充分混匀，再倒入适量的精子稀释液(0.2%的生理盐水)，并用毛笔轻轻搅动精卵，使之充分混合，然后加入晾晒过的自来水，轻轻搅拌，倒掉一部分水，再加入新水，如此反复多次，尽快地冲洗掉多余的精液，同时，尽量使所有的卵粒都散开，观察到卵膜吸水膨胀后，加水深约1cm，受精卵在盘中静水孵化.

1.4 人工孵化

静水孵化是在室内进行，并用硬纸板对孵化盘进行遮光处理，孵化水温在18－20℃，孵化过程中每8个小时换水一次，每次换去托盘中2/3的水，缓缓加入新水，避免水流过大冲击受精卵.换水时挑去发白的鱼卵，当镜检发现受精卵处于囊胚后期或原肠胚前期，统计受精率.3天左右鱼卵孵化出膜，统计出苗数，之后每次换水挑去发育过程中的死胚，8天左右，健康的仔鱼能正常平游，统计出苗数.

1.5 激素测定

为了比较泰山螭霖鱼催产前后体内促性腺激素(GtH)的水平变化，本研究于5月16日和29日先后进行了两次测定.具体方法为:每次均对雌雄各6尾亲鱼进行注射催产，剂量为HCG25IU+LHRHA20.4μg+DOM0.2mg/尾(催产组)，0.6%生理盐水0.15ml(阴性实验对照组)在催产前和注射催产激素12h后分别随机抽取雌雄泰山螭霖亲鱼各3尾，进行尾静脉采血(1mL/尾)，所抽取血液均加入离心管并做好标记，室温放置2h，1000 rpm/min离心20 min，取上清，用鱼类促性腺激素释放激素ELISA试剂盒(南京森贝伽公司所生产)，测定样品中鱼促性腺激素(GtH)的含量.

1.6 数据统计与分析

用SPSS 22.0统计软件包中的fisher精确概率法对催产组和对照组进行卡方检验，P＜0.05为差异显著.

2 结果

2.1 催产效果

各批次亲鱼，经2次尝试挤卵，其中第4批次催产率最高，为66.7%，第1批次催产率为25%，第2、3批次均不理想，分别有2个和1个催产组在注射催产药物后，未表现出应有的效应.各批次的受精率较高，鱼卵破膜率也较高，而出苗率很低，详见表1.

表1 螭霖鱼催产及受精卵孵化情况

本次实验中，第一批次产卵5尾，未产15尾.第二批次中第1、2催产组均为产卵1尾，未产2尾.第三批次第1、2催产组均为产卵1尾，未产4尾.第四批次产卵4尾，未产2尾，详细结果见表2.卡方检验结果显示前三批次中催产组与对照组之间的差异不显著(P＞0.05)，第四批次中催产组与对照组之间差异显著(P＜0.05).结果见表2.

表2 人工催产组与对照组情况对比

2.2 注射催产激素对螭霖鱼促性腺激素(GtH)的影响

5月16日和29日两次注射催产激素后，均发现雄鱼有不断追逐雌鱼现象，放入产卵沙盆12h后未实现其自然产卵.通过测定促性腺激素(GtH)发现，5月16日催产组前后雄鱼体内GtH含量平均为475ng/L和570ng/L，催产前后雌鱼体内GtH含量平均为210ng/L和380ng/L.5月29日催产前后雄鱼体内GtH含量平均为385ng/L和505ng/L，雌鱼体内GtH含量平均为192ng/L和267.5ng/L，而注射生理盐水的对照组内雌雄鱼体内激素变化不大，结果详见表3.

表3 激素对螭霖鱼体内促性腺激素(GtH)的影响

3 分析与讨论

鱼类繁殖是在下丘脑—脑垂体—性腺轴的控制下完成的.利用外源激素处理是控制养殖鱼类繁殖成熟的重要可靠方法.最常用鱼类催产剂有绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素释放激素(LHRHA)、鱼类脑垂体(PG)等，外源激素可刺激脑垂体释放促性腺激素(GtH)，诱导卵巢性腺类固醇激素的生成和卵子的排放.

HCG是从妊娠早期的孕妇或孕畜尿中提取出来的一种糖蛋白激素，可直接作用于性腺，具有诱导排卵的作用.刘永进等人通过对泰山螭霖鱼亲鱼注射1IU/g的HCG进行人工催产，取得了较好效果［7］.但我们三个批次的HCG单剂注射催产实验，催产效果均不理想(催产率25%－33%).造成这种差异的原因是HCG的选择与性腺发育程度密切相关，刘永进［7］等人催产日期为5月22日，晚于我们的催产日期，分析可能他们所用的亲鱼成熟程度好，正符合了HCG所具有较强促排卵的作用，但催熟机制不及垂体和释放激素类似物的特点.笔者认为单用HCG催产螭霖鱼时，效果不佳.尤其是在螭霖鱼繁殖初期，即使增加用量到1.2IU/g和1.5IU/g，催产效果仍不明显.我们在随后的人工挤卵时发现有个别雌鱼腹部膨大、变硬，生殖孔红肿，轻压腹部有浑浊并微带有黄色液体流出，这可能是高剂量的HCG使鱼卵快速吸水膨胀，无法产出体外，而在体内退化所致.

LHRH－A是一种人工合成的九肽激素，相对分子质量小，反复使用不会产生抗药性，并对温度的变化敏感性较低.地欧酮(DOM)是一种多巴胺抑制剂，可以抑制或消除促性腺激素释放激素抑制激素(GRIH)对下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的影响，从而增加脑垂体GtH的分泌，促使性腺发育成熟.Linpe方法(即LHRH－A加多巴胺D2受体拮抗剂地欧酮)广泛用于鲢、鳙、草、青鱼的人工催产［9］.本研究中第三批次第三催产组利用这两种催产剂对螭霖鱼进行催产，两次尝试挤卵均未成功，分析可能与亲鱼性腺发育成熟度差、样本小有关.同泰山螭霖鱼同属鲃亚科的倒刺鲃，采用一次注射催产激素后再采用人工授精的方法，催产成功并获得产卵率80%的好效果，催产剂种类和剂量为雌鱼注射LHRHA24μg+DOM 5mg/kg［10］.因此，LHRH－A2+DOM对螭霖鱼的催产效果仍需进一步验证.

目前，鱼类催产中多用这三种激素互相混合使用，注射剂量受亲鱼性腺发育成熟度、水温、雌雄比等因素影响.我们第三批次混合这三种催产剂对螭霖鱼进行催产，效果仍然不理想.刘传忠［6］等人给每尾雌鱼(93g)注射剂量为HCG150UI+LHRH－A23μg，但注射催产药物后，螭霖鱼亲鱼未表现出应有效应.这与本研究第三批次出现的现象较一致，这可能与HCG注射剂量偏大、1次注射、注射时机不适等因素有关.大剂量催产药物的使用以及时机过早可能是我们催产失败的原因.

在最适宜的时机对亲鱼进行催产，是家鱼人工繁殖取得成功的关键因素之一［9］.我们在进行第四批次的催产实验时，挑选了腹部膨大、柔软有弹性，生殖孔红润的雌鱼作为催产组，采用和第三批次的实验组近似的注射剂量，取得了不错的催产效果，催产率达到了66.7%，催产组与对照组相比差异显著.这可能与本批次催产时机合适有关.目前，催产时机都是以雌鱼腹部柔软膨大、生殖孔红肿等主观判断，影响因素较多，增加了生产上的难度.

本研究中有个明显的特点就是首次对泰山螭霖鱼进行全人工繁殖试验，这在螭霖鱼人工繁殖研究中还是首次.经过人工注射催产、人工挤卵、人工授精、人工孵化等阶段，成功孵化出1000余尾仔鱼.本研究中受精率高(72%－95%)，鱼卵破膜时间较短(＜3d)，破膜率较高(50%－82%)，但破膜仔鱼畸形较多，如歪尾、曲背、卵黄囊肿大等，畸形仔鱼绝大多数均陆续夭折，导致整体出苗率很低(10%左右).造成这种现象的原因有两点:一是人工挤卵最佳时机较难掌握，挤出的卵子有时不够成熟或过熟，即使精卵能受精，胚胎的畸形率和死亡率也较高，进而影响出苗率.二是螭霖鱼胚后期很长，从破膜到仔鱼平游仍需7－8天.而出膜后，虽属胚后阶段，但刚出膜的仔鱼发育很不完善，无胸鳍保持平衡，无鳔不能上下沉浮，眼睛无色素不能感光，肠道未通，不能摄食.它全身裸露在水中，做抛石式扭动，对溶氧需求骤然增加，它们对不良环境的适应能力最差，导致本研究中出苗率低.所以，螭霖鱼苗破膜后采用何种孵化方式培育就显得尤为重要.

本研究结果表明，催产激素的注射可提高雌雄亲鱼体内促性腺激素(GtH)的水平.GtH的分泌受到下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)和多巴胺的双重调节，排卵和产卵也是以血清GtH的急剧升高为先导的，而最终能否排卵还有赖于血清GtH峰是否超过“排卵阈值”［11］.尽管注射催产激素后的螭霖鱼雌鱼血清GtH水平也有大幅提高，但仍低于雌鱼，也没有实现自然产卵，可能因为雌鱼血清GtH峰未达到“排卵阈值”.对螭霖鱼来说，繁殖困难在于雌鱼性腺发育成熟并成功产卵，因为雄鱼性腺发育成熟早且持续时间长，这种情况在硬骨鱼类中具有一定的普遍性.尽管第五、六批次注射激素并未实现螭霖鱼的自然繁殖，但这与注射时间过晚，雌雄鱼性腺均已退化有关.本研究说明适量的催产剂及催产时机可实现螭霖鱼的全人工催产繁殖.

［1］陈红菊，姜运良，宋憬愚，等.泰山赤鳞鱼胚胎发育的研究［J］.水生生物学报，2008，32(6):926－933.

［2］张安才，陈红菊，邹兰柱，等.泰山赤鳞鱼肌肉营养成分分析与评价［J］.齐鲁渔业，2010，27(9):1－3.

［3］张安才.泰山赤鳞鱼的生物学及人工养殖技术［J］.齐鲁渔业，2005，22(8):31－32.

［4］张玉杰，郭冰，田江，等.黄颡鱼高效人工繁殖技术［J］.水产养殖，2011(3):31－33.

［5］胡廷尖，储张杰，王雨辰，等.泥鳅规模化人工催产与孵化的研究［J］.浙江海洋学院学报(自然科学版)，2012，31(1):12－17.

［6］刘传忠，邱鹏，孙剑，等.泰山赤鳞鱼繁殖与苗种培育［J］.淡水渔业，2005，35(6):55－56.

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［11］王德寿，林浩然.诱导大鳍鳠和长吻鮠排卵过程中血清G T H水平的变化［J］.水生生物学报，2001，23(2):185－189.

A Preliminary Study on the Technology of Artificial Reproduction of Varicorhinus Macrolepis

LIN Zhen－xian，GAN Qing－meng，ZHANG Cong
(School of Biology and Brewing Engineering，Taishan University，Tai＇an，271000，China)

The aim of the present study is to find the controlling factors of the artificial inducement reproduction of varicorhinusmacrolepis.Different types and doses of oxytocin were injected into the parents of varicorhinusmacrolepis for artificial inducement reproduction，and concentrations of gonadotropin(GtH)in male and female parent fish were measured before and after the injection of oxytocin.Results showed that the highest spawning rate group was which was injected with 25IU Human Chorionic Gonadotropin(HCG)+0.4μg Luteinizing Hormone Releasing Hormone－A2(LHRH－A2)+0.2mg Domperidone(DOM)，and the spawning rate reached 66.7%，which was significantly higher than the control group.After waiting for about 12 hours，eggs were squeezed and inseminated artificially，and then the fry was hatched successfully.Secondly，the effect of oxytocin was associated with the development level of the parent fish.Finally，the injection of oxytocin could improve the level of gonadotropin(GtH)in male and female parent fish.

varicorhinusmacrolepis;artificial inducement reproduction;gonadotropin(GtH)

S961.2

A

1672－2590(2015)06－0094－05

2015－10－11

国家级大学生创新创业训练计划项目(201410453011)

林贞贤(1979－)，男，山东新泰人，泰山学院生物与酿酒工程学院讲师.