海带渣微生物药肥对土壤中产毒真菌寄生曲霉的抑制作用研究

肖 伟, 闫培生

哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院,山东 威海 264209



海带渣微生物药肥对土壤中产毒真菌寄生曲霉的抑制作用研究

肖 伟, 闫培生*

哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院,山东 威海 264209

研究了施用多功能生防芽孢杆菌Hitwh-BA2菌株发酵生产的海带渣微生物药肥对栽培土壤中产毒真菌寄生曲霉的生态防治效果。结果表明：施用海带渣微生物药肥能极显著的降低栽培土壤中寄生曲霉的数量水平，有效降低寄生曲霉占总真菌数的百分含量，其作用效益优于海带渣；施用海带渣微生物药肥能极显著提高栽培土壤中细菌的数量水平，作用效果极显著优于海带渣。研究结果期望为土壤黄曲霉毒素产毒真菌的防控提供参考。

海带渣微生物药肥；海带渣；寄生曲霉；生态防治

在环境有害微生物生态防治体系中，植物病害可以看成是植物所处的生物因素和非生物因素相互作用的生态系统失衡所致，因此植物病害的生态防治就是通过各种措施来实现植物所处的生物因素与非生物因素平衡的重建，最终将病原微生物种群的数量与危害性控制在经济、生态和社会效益允许的阈值之内，确保植物生态系统群体的健康发展。这与传统的对于环境中植物病害的化学防治所期望的“铲除”的作用效果是不同的。

花生是我国重要的油料作物，其总产量居我国油料作物之首。黄曲霉是花生生产过程中最主要的产毒真菌，严重威胁着花生的产量和品质，其中黄曲霉毒素B1被世界卫生组织列为1类致癌物[1]。黄曲霉毒素的污染危害已严重影响了我国花生的生产、食用安全和出口创汇。对于花生生产过程中黄曲霉侵染的生态防治过程，可以这样认为：从花生与花生所处的微生态环境出发，通过对花生生长环境中生物因素与非生物因素进行调控，增强花生自身抗黄曲霉侵染的能力[2～5]，增加土壤微生态环境中有益微生物的数量，提高土壤自身的抑菌能力，降低土壤中产黄曲霉毒素病害真菌的数量水平，从而对花生黄曲霉污染进行有效防治。

施用有机菌肥是植物病害生态防治的重要手段。有机菌肥是有机质与有益菌的有效结合体，兼具两者的某些特性。其中以有益菌特别是植物病原微生物拮抗菌为研究对象的生物防治手段是植物病害生态防治的重要组成部分[6]；而其中的有机质，特别是无害的工农业固体废弃物用于有机菌肥的生产，是这些有机废弃物资源化利用的主要途径[7]。

地球上四分之三的面积是海洋，我国是一个海洋大国，随着我国经济的快速发展，海洋战略已经上升为我国的国家战略，我国加快了对海洋资源开发利用的脚步。海洋中大量的海藻资源对于人类而言是巨大而宝贵的财富。海带渣是海带加工过程中最大宗的固体废弃物，其主要成分为海藻纤维、蛋白质、海藻多糖、壳聚糖、多酚和甜菜碱等，并且还含有大量的碱性金属离子[8,9]。传统处理海带渣的主要方式是卫生填埋，但这种方式不仅造成了土壤资源的浪费，更浪费了海带渣中未被利用的有机质成分。因此围绕海带渣(海藻)的资源化利用，科研工作者们展开了广泛的研究。在海带渣综合利用方面，一般主要集中在饲料添加剂[10]、有机肥[11]、膳食纤维原料[12～14]、酸性土壤调节剂[9]，以及作为基质用于生产燃料乙醇等[15，16]。利用海带渣以及海藻进行有机菌肥的生产具有广阔的前景。本实验通过盆栽方式对施用海带渣微生物药肥防控产毒真菌寄生曲霉在土壤中的群体数量变化进行了初步研究，以期为有效防控作物的黄曲霉毒素污染提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用产毒真菌为寄生曲霉NFRI-95，由日本国家食品研究所提供。该菌株是寄生曲霉的一株突变菌株，其不能产生黄曲霉毒素，但能积累红色黄曲霉毒素中间产物的norsolorinin acid(NA)，其最适生长pH在6.0左右。盆栽花生品种为花育17，购自当地农贸市场，该品种对寄生曲霉的侵染敏感[17]。

1.2 培养基配方

DG18培养基：5.0 g/L蛋白胨，10.0 g/L葡萄糖，1.0 g/L磷酸二氢钾，0.01 g/L硫酸锌，0.5 g/L硫酸镁，0.005 g/L硫酸铜，0.002 g/L氯硝铵，0.05 g/L氯霉素，0.05 g/L盐酸金霉素，15 g/L琼脂。

GY固体培养基：20 g/L 葡萄糖，5 g/L酵母粉，20 g/L琼脂。

1.3 海带渣微生物药肥的制备

将试管斜面上的具有广谱抑制病原真菌生长并且能产生植物生长激素6-KT的生防芽孢杆菌Hitwh-BA2取一环接种到装有20 mL GY培养液(含20 g/L葡萄糖和5 g/L酵母粉)的三角瓶中在摇床上培养12 h(35℃，150 r/min)；将海带渣粉碎至0.5 mm，在培养瓶中装37.4 g干海带渣、2.1 g蔗糖、0.5 g KNO3与60 mL去离子水，pH为自然，灭菌，按照4%的接种量将制备好的生物菌母液接种到固体培养基中，在35℃进行固体发酵8 d，备用。

1.4 盆栽实验

实验模拟在土壤被产毒真菌寄生曲霉NFRI-95人工接种浸染的条件下，研究施用海带渣微生物药肥对减少土壤中寄生曲霉NFRI-95群体数量水平和增加土壤中细菌水平的作用。试验分3个处理组，即：处理组1(对照，不施用海带渣微生物药肥与海带渣)、处理组2(施用20 g海带渣微生物药肥)和处理组3(施用20 g海带渣)。花生盆栽如下：从农田中取回20 kg左右的花生盆栽用土，去除土壤中的杂质使土壤均一。向栽培土中接种寄生曲霉NFRI-95孢子，使寄生曲霉NFRI-95的孢子数为1×104个孢子/g土壤。实验采用塑料花盆(直径230 mm)进行盆栽，每个处理3个花盆，每盆装土2.1 kg，按照实验处理组的设计进行分组装盆，并按照随机区组实验设计进行排列。施入花盆中的海带渣微生物药肥或海带渣与花盆中的土壤充分混匀。盆栽准备完毕后进行花生种子的播种，每个处理组播种30粒(10粒/盆)，采用穴播的方式，播种深度为5 cm左右。花生出苗后对盆中的花生进行间苗，每盆保留4株花生。

1.5 土壤中微生物数量的测定

土壤中寄生曲霉NFRI-95与总真菌数的测定：实验选择DG18培养基来进行各个时期花生栽培土壤样本中寄生曲霉NFRI-95和总真菌数的测定。具体操作如下：取不同处理组花生各个时期(苗期A、花期B和收获期C)根际土壤样本和根外土壤样本，并采用稀释涂平板法对寄生曲霉NFRI-95与总真菌数进行检测，即：用无菌水对土壤样本进行10倍稀释，取100 μL稀释液到含有DG-18培养基的培养皿中，用涂布器进行涂布，每个处理2个重复，28℃条件下培养3～4 d，观察记录在DG-18培养基上所生长的寄生曲霉NFRI-95数与真菌总数；对各个土壤样本的含水量进行检测，用于各个处理组单位土壤中寄生曲霉NFRI-95与总真菌数的比较。

土壤中细菌数的测定：实验选择GY培养基进行各个时期花生栽培土壤样本中细菌数的检出。具体操作如下：取花生各个时期(苗期A、花期B和收获期C)不同处理组花生根际土壤样本和花生根外土壤样本，并采用稀释涂平板法对各个土壤样本中细菌数进行检测，即：用无菌水对土壤样本进行107倍稀释，取100 μL稀释液到含有GY培养基的培养皿中，用涂布器进行涂布，每个处理2个重复，35℃条件下培养1 d，观察记录在GY培养基上所生长的细菌总数；对各个土壤样本的含水量进行检测，用于各个处理组单位土壤中细菌数的比较。

1.6 数据分析

利用SPSS软件对盆栽花生不同时期根外与根际土壤中寄生曲霉NFRI-95、真菌总数和细菌总数的实验数据进行比较均值单因素ANOVA的统计分析。

2 结果与分析

2.1 施用海带渣微生物药肥对栽培土壤中寄生曲霉与总真菌数量的影响

不同时期花生盆栽根外土壤与根际土壤中寄生曲霉NFRI-95与总真菌数的检测结果分别见表1和表2。

结果表明，苗期施用海带渣微生物药肥能极显著的降低根际外土壤中寄生曲霉NFRI-95的数量水平，施用海带渣微生物药肥的作用效果优于海带渣，但两者之间差异不显著；施用海带渣微生物药肥与施用海带渣对于根际外土壤中真菌总数的影响并不显著。花期施用海带渣微生物药肥能极显著的降低根际外土壤中寄生曲霉NFRI-95的数量水平；施用海带渣微生物药肥的作用效果优于海带渣，两者之间差异极显著；施用海带渣微生物药肥与施用海带渣对于根际外土壤中真菌总数的影响不显著。收获期施用海带渣微生物药肥能显著降低根际外土壤中寄生曲霉NFRI-95的数量水平，施用海带渣微生物药肥的作用效果优于海带渣，两者之间差异显著；同时这一时期施用海带渣微生物药肥能极显著的增加栽培土壤中的真菌总数。

表1 根外土壤样本中寄生曲霉NFRI-95与总真菌数的检测结果Table 1 The number of A.parasiticus NFRI-95 and total fungi outside rhizosphere soil sample.

注：A为苗期，B为花期，C为收获期。1,2,3为不同的处理组。每个处理组以同一时期的处理组1为对照，*表示在P<0.05水平上差异显著，**表示P<0.01水平上差异显著。

表2 根际土壤样本中寄生曲霉NFRI-95与总真菌数的检测结果Table 2 The number of A.parasiticus NFRI-95 and total fungi in rhizosphere soil sample.

注：A为苗期，B为花期，C为收获期。1,2,3为不同的处理组。每个处理组以同一时期的处理组1为对照，*表示在P<0.05水平上差异显著，**表示P<0.01水平上差异显著。

从实验的结果看：施用海带渣微生物药肥能极显著的降低栽培土壤中产毒真菌寄生曲霉NFRI-95的数量水平，施用海带渣微生物药肥的作用效果优于海带渣。除收获期外，施用海带渣微生物药肥和施用海带渣对于栽培土壤的真菌总数的数量水平影响并不大。

2.2 施用海带渣微生物药肥对栽培土壤中细菌数量水平的影响

不同时期花生盆栽根际外土壤与根际土壤中细菌数的检测结果如表3。

表3 栽培土壤中细菌数的检测Table 3 The number of bacteria in soil sample.

注：A为苗期，B为花期，C为收获期。1,2,3为不同的处理组。每个处理组以同一时期的处理组1为对照，*表示在P<0.05水平上差异显著，**表示P<0.01水平上差异显著。

结果表明，在不同时期根际外土壤与根际土壤中细菌数具有相似的变化趋势，与对照相比，施用海带渣微生物药肥与海带渣均能极显著的增加栽培土壤中细菌的数量水平；且施用海带渣微生物药肥的作用效果优于施用海带渣的作用效果，两者之间差异极显著。

3 讨论

从栽培土壤中寄生曲霉NFRI-95与真菌的数量水平随栽培时间的变化趋势看，寄生曲霉NFRI-95的数量水平与占土壤中总真菌数的百分含量总体呈现降低的趋势。花生收获期根际外土壤样品中，未施用海带渣微生物药肥与海带渣的处理组中寄生曲霉NFRI-95数占真菌总数的47.9%；施用海带渣微生物药肥处理组中的寄生曲霉NFRI-95数占真菌总数的9.4%；施用海带渣处理组中的寄生曲霉NFRI-95数占真菌总数的25.2%。花生收获期时根际土壤样品中，未施用海带渣微生物药肥与海带渣的处理组中寄生曲霉NFRI-95数占真菌总数的62.5%；施用海带渣微生物药肥处理组中的寄生曲霉NFRI-95数占真菌总数的17.6%；施用海带渣处理组中的寄生曲霉NFRI-95数占真菌总数的24.5%。可见施用海带渣微生物药肥能有效地降低土壤中产毒真菌寄生曲霉NFRI-95的数量水平与百分含量，较低的数量水平降低了寄生曲霉NFRI-95对花生的侵染机会，较低的百分含量有利于其他真菌在土壤中对产毒真菌寄生曲霉NFRI-95形成有效的营养竞争与生态位竞争，从而有效的控制产毒真菌寄生曲霉NFRI-95对花生的侵染。与此同时，施用海带渣微生物药肥极显著的提高了土壤中细菌的数量水平，本课题组的前期研究结果也表明施用海带渣微生物药肥能极显著的提高栽培土壤抑制寄生曲霉NFRI-95活性的能力[18]，这反映了施用海带渣微生物药肥后，其内的生防芽孢杆菌Hitwh-BA2菌株在土壤中形成了有效定殖，发挥了对产毒真菌寄生曲霉NFRI-95的防治作用。

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Inhibition Effect of Kelp Residue Microbial Fertilizer on Mycotoxin-producing FungusAspergillusparasiticusin Soil

XIAO Wei,YAN Pei-sheng*

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShangdongWeihai264209,China

The inhibition effect of kelp residue microbial fertilizer on mycotoxin-producing fungusAspergillusparasiticuswas studied.The kelp residue microbial fertilizer was fermented with bio-controlBacillusHitwh-BA2.Results showed that kelp residue microbial fertilizer have extremely significantly reduced the number ofA.parasiticusandA.parasiticuspercentage of total number of fungi,and its effect was better than kelp residue; kelp residue microbial fertilizer have extremely significantly improved the number of bacteria in cultivated soil,and the effect of kelp reside microbial fertilizer and kelp residue were extremely significant difference.The results suggestted that kelp residue microbial fertilizer could be used in biocontrol of aflatoxin-producing fungi in soils.

kelp residue microbial fertilizer; kelp residue;Aspergillusparasiticus; ecological control

2015-03-20; 接受日期：2015-04-16

国家自然科学基金(30870003);威海市科技发展研究计划项目(2010-3-96);哈尔滨工业大学优秀团队支持计划资助。

肖伟，博士研究生，主要从事植物病理、植物病害的生物防治与生态防治研究。E-mail：tuerxiao@yeah.net。*通信作者：闫培生，教授，博士生导师，博士，主要从事海洋微生物资源利用、海洋生物质及其加工废弃物的高值资源化、有害微生物的生物防治与生物农药、微生物发酵工程与生物制药研究。E-mail：yps6@163.com。

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.11