浙江近海三疣梭子蟹养殖与野生群体的基因组微卫星分析

李鹏飞，徐开达，周宏霞

（1.浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，农业部重点渔场渔业资源科学观测实验站，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021；2.威海市产品质量监督检验所，山东威海 264210）

三疣梭子蟹Portunus trituberculatus，属甲壳纲Crustacea、十足目Decapoda、梭子蟹科Portunidae，广泛分布于中国的四大海域。三疣梭子蟹味道鲜美，食用价值极高，在中国属于重要的海洋经济蟹类之一，因此而成为重要的海洋水产养殖对象。自上世纪50年代，学者们就开始对三疣梭子蟹进行研究，从最初的生殖、生理生态、数量分布、病理等基础研究开始，至近十几年前，越来越多的学者在遗传学方面对不同群体的三疣梭子蟹进行了不同程度的研究报道[1-5]。近几年来，我国沿海各地开展了大规模的三疣梭子蟹人工养殖，而且养殖技术非常成熟，在浙江，三疣梭子蟹的人工养殖更是广泛。三疣梭子蟹养殖业的蓬勃发展加快了中国沿海三疣梭子蟹苗种的南北交流，造成其种质资源的混杂，必然产生了其种质资源管理和保护等方面的问题。另外，三疣梭子蟹放流技术也很成熟，在浙江，每年都有大规模的三疣梭子蟹人工增殖放流，尤其近几年，在“东海无鱼”的影响下，在加大各种海洋经济物种增殖放流规模的政策影响下，浙江沿海三疣梭子蟹的放流力度更是加强，以至于2014年出现了三疣梭子蟹卖出白菜价格的现象。如此大规模的增殖放流必然会对自然海域三疣梭子蟹野生群体的遗传结构产生影响，因此，我们应该加大对野生三疣梭子蟹资源的保护力度，监测和保护其种质资源，建立三疣梭子蟹的保护区和原种场，以降低三疣梭子蟹野生资源的遗传衰退速度，防止野生群体的种质退化和优良性状的丧失，同时，要加强蟹苗规范化管理，有计划地开发利用浙江近海三疣梭子蟹资源，保持其进化潜力和可持续利用，真正实现对三疣梭子蟹资源的合理开发利用[6]。

微卫星标记因其多态性丰富，稳定性好等众多优点，被广泛地应用于种质鉴定及遗传育种等研究。用微卫星标记研究三疣梭子蟹的报道也比较多[7-9]，但是用微卫星标记研究比较浙江近海三疣梭子蟹种质极遗传方面内容的报道未见。本研究利用微卫星标记用毛细血管电泳法对浙江近海三疣梭子蟹野生群体及苗种场的亲蟹、仔蟹进行遗传分析，以期为浙江近海三疣梭子蟹野生群体种质资源的保护和遗传育种研究提供理论的科学依据，也为三疣梭子蟹苗种场的人工选育提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本研究的三疣梭子蟹4个群体中，2个群体是西轩试验场的亲蟹（A群体，捕自浙江近海180海域，野生群体）及其子一代的幼蟹（B群体，养殖群体），另外2个群体分别是同年从162-169海域（C群体，野生群体）、177-178海域（D群体，野生群体）捕获的三疣梭子蟹样品中随机取得，三个野生群体均为长江口附近海域。三疣梭子蟹样品取得后，取其大螯肌肉于超低温冰箱中保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取

三疣梭子蟹DNA提取方法是参照《分子克隆实验指南》[10]中DNA的提取方法，提取基因组DNA后放于超低温冰箱中保存。

1.2.2 微卫星分析

对大量的微卫星位点进行了筛选，最终选择了6个微卫星位点[7，8]用于实验，用毛细血管电泳法对4个群体的三疣梭子蟹进行了STR微卫星检测。所用微卫星位点的基本特征见表1。

表1 三疣梭子蟹6个微卫星位点的基本特征Tab.1 Characterization of 6 microsatellite markers for P.trituberculatus

2 实验结果与分析

通过用毛细血管电泳法对4个群体的三疣梭子蟹进行了STR微卫星检测，获得了微卫星检测数据，每对引物中A、B、C、D四个群体其中一个个体在的检测结果如图1所示：

图1 6个位点分别在4个三疣梭子蟹群体中（依次为：A、B、C、D）的一个个体中扩增得到的电泳图谱Fig.1 Six loci amplified in 1 individual in 4 populations of Portunus trituberculatus(in turn A、B、C、D)

用CERVUS和Genepop V4软件进行数据处理，获得了等位基因数、多态信息含量、观测杂合度、期望杂合度。

结果显示，所选的的6个微卫星位点均为多态位点，6个位点在4个三疣梭子蟹群体中96个个体中共扩增得到227个等位基因，每个位点含有26～48个等位基因不等，平均每个位点的等位基因为38个，PRT6b的等位基因数最多。

多态信息含量是衡量遗传标记位点变异程度高低的一个标准。多态信息含量可以反映出某个标记所包含或所提供的遗传信息内容，根据多态信息含量的计算方法[11]，当多态信息含量>0.5时，位点为高度多态信息位点，当0.25<多态信息含量<0.5时，为中度多态性位点，当多态信息含量<0.25时，为较低多态位点，基本上不用来研究分析遗传多样性。经分析，本研究所选6个位点的多态信息含量在范围为0.919 7～0.966 0，说明6个位点能够很好的反映4个群体内和群体间的遗传关系。

杂合度作为反映多态性高低的一个重要参数，杂合度的大小可以反映群体等位基因的丰富程度及群体遗传变异的高低。一般情况下，杂合度的数值越大说明群体的变异型越大，遗传多样性也就越丰富。经分析，4个群体的平均观测杂合度在0.478 7和0.915 8之间，平均期望杂合度在0.924 5和0.966 0之间。该结果表明4个群体均出现较高的遗传多样性。本研究结果显示4个群体的三疣梭子蟹都处于较高的遗传多样性水平。通过对4个群体6个位点的卡方检验发现，除了PTR33a表现为极度显著偏离Hardy-Weinberg平衡外，其余位点均符合Hardy-Weinberg平衡。经群体间的遗传分化检测发现，6个位点的Fst值在0.014 2-0.049 8之间，均小于0.05，说明4个群体间未产生遗传分化。

根据微卫星数据计算了4个群体的遗传距离和相似度（对角线上），如表2，并根据遗传距离构建了4个群体的UPGMA聚类树，如图2。结果显示亲蟹A群体和其子一代B群体的遗传距离相对较大，与其他2个野生群体的遗传距离相对较小。反映在系统树上，也得到了相同的结果。

图2 三疣梭子蟹4个群体的UPGMA系统树Fig.2 The UPGMA phylogenetic tree based on the D-loop of 4 populations

表2 三疣梭子蟹4个群体间和群体内的遗传距离和相似性指数Tab.2 Genetic distance and identity of P.trituberculatus from 4 populations

3 讨论

众所周知遗传多样性的研究是遗传育种过程中必须的研究内容，对于种质资源的管理和保护也具有重要的意义。在遗传学育种工作中，微卫星标记也是非常有效的一种分子标记技术。本研究用微卫星的方法对浙江长江口和附近海域的三疣梭子蟹及苗种场三疣梭子蟹亲蟹和其子一代共4个群体进行了遗传多样性研究，获得了三疣梭子蟹种质资源遗传变异的基本数据，并取得了较好的分析结果，结果表明了研究的4个群体的三疣梭子蟹都具有较高的遗传变异，与笔者用控制区序列分析的方法[6]对该4个群体的遗传多样性研究的结果相似。近年来，随着浙江对三疣梭子蟹放流力度的加大，势必会造成自然海域中三疣梭子蟹种质资源的混杂，而每年的亲本大多又取自自然海域，从本研究的结果看，虽然繁育的子一代三疣梭子蟹也具有较高的遗传多样性，但是相对于野生群体来说遗传多样性稍有下降。本研究结果为三疣梭子蟹育苗场加强遗传育种，实现对三疣梭子蟹的合力开发利用提供了基础数据，也为三疣梭子蟹的种质资源保护、原种场的建立及人工放流方案的制定等提供科学依据。

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