清毒片体外抗H1N1亚型流感病毒的研究

王学文，李永清，章振华，陈小玲，郑振辉，康爱君，赵德明

（1.中国农业大学动物医学院，北京 100193；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097；3.北京维通利华实验动物技术有限公司，北京 100107；4.北京大学医学部动物部，北京 100191）

流感病毒（Influenza virus，IV）属于正黏病毒科成员，为单分子负链RNA病毒，主要分为甲、乙、丙3型。H1N1亚型流感病毒主要侵害人和动物的呼吸系统。它引起的症状及并发症严重，且病死率比较高。目前，用于治疗甲型流感的西药合成药物金刚烷胺、达菲等虽有抑制病毒作用，但其毒副作用大，妨碍其广泛应用，且在发达国家还出现了达菲耐药现象［1］。中药抗H1N1亚型流感病毒研究和应用已引起国内外广泛关注［2-3］，证实中药作用靶点多，既可直接杀灭病毒作用，又有抑制病毒复制作用，不良反应少，药源丰富，价格低廉且重视病毒、机体和中药三者辩证施治关系。近年来中草药抗病毒研究已成为当今医药开发关注的热点。清毒片是由多种中药成分组成的复方中药，该中药针对解热镇痛、抗病毒、抗感染和调节免疫功能而组方。为验证其是否具有抗H1N1亚型流感病毒的功效，本试验对清毒片体外抗H1N1亚型流感病毒的作用进行研究，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 清毒片，是由北京洪天力药业有限公司提供的棕色药片（批号：20130303）；盐酸金刚烷胺、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清为美国Hyclone公司产品。

1.1.2 细胞与病毒 流感病毒 A／Guangdong／sz223／1997（H1N1）由北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽生物制剂高技术研究室冷冻保存；犬肾上皮细胞（MDCK）由北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽生物制剂高技术研究室提供，2d～3d传代1次。

1.2 方法

1.2.1 药物配制

1.2.1.1 清毒片配制 用分析天平称取1g清毒片于100mL烧杯中，然后在烧杯中加入20mL 100℃去离子水，迅速搅拌均匀后，再加入80mL热水，继续搅拌至充分溶解，冷却过滤除菌，即得到浓度为10 000μg／mL的清毒片溶液，作为母液4℃保存，用时稀释至所需浓度。

1.2.1.2 金刚烷胺配制 用分析天平称取0.1g金刚烷胺于100mL烧杯，加入80mL去离子水，混匀溶解，然后过滤除菌，即得到1 250μg／mL金刚烷胺无菌溶液，然后再稀释至所需浓度即可，现用现配。

1.2.2 MTT法测定清毒片对MDCK细胞的半数毒性浓度（TC50） 将MDCK细胞分别接种于96孔板，每孔200μL，含细胞2×104个／孔，37℃、体积分数为5%CO2培养24h，细胞长成单层。吸去上清，分别加入10 000、5 000、2 500、1 250、625、312.5、156.25、78.125、39.06μg／mL清毒片溶液，每浓度4孔，设细胞对照（细胞＋培养基）。设金刚烷胺为阳性对照药，浓度梯度为312.5、156.25、78.125、39.06μg／mL，每浓度4孔，观察96h后结束试验，加MTT染色4h，吸去上清加DMSO溶解0.5h，用酶标仪测定OD 570nm值，用统计软件SPSS13.0对数据进行Probit回归分析，计算药物的TC50。

1.2.3 细胞病变（CPE）法测定病毒对 MDCK细胞的半数感染量（TCID50） 原病毒液在鸡胚尿囊腔中培养传代3次后，测定血凝滴度为1∶128。MDCK细胞上适应传代并观察细胞病变，发现明显病变且稳定3代后，同时测定TCID50。将MDCK细胞接种于96孔板，每孔200μL，含细胞2×104个／孔，37℃培养24h，细胞长成单层，将病毒液用培养液依次10倍稀释10-3～10-12共10个浓度加至前10排细胞孔内，每浓度8孔，最后两排作为细胞对照孔，只加入细胞维持液，37℃、体积分数为5%CO2培养箱培养。每天用倒置显微镜观察细胞病变。记录细胞病变程度，连续观察96h后结束试验。用Reed-Muench法计算病毒TCID50。

1.2.4 清毒片抗 H1N1作用

1.2.4.1 清毒片抑制 H1N1生物合成作用 将MDCK细胞接种于96孔板，每孔200μL，含细胞2×104个／孔，37℃、体积分数为5%CO2培养24h，细胞长成单层。加入100μL（100TCID50）病毒，吸附2h后，弃去上清液，随后再分别加入1 250、625、312.5、156.25、78.125、39.062μg／mL清毒片溶液，每孔100μL，每浓度4孔。同时设病毒对照（细胞＋病毒＋培养液）、细胞对照（细胞＋培养液）、清毒片对照（1 250μg／mL的清毒片溶液＋细胞＋培养液），另设金刚烷胺为阳性对照药，浓度梯度为312.5、156.25、78.125、39.062μg／mL，每浓度 4孔。逐日观察细胞形态变化，当病毒对照孔细胞出现病变时，记录细胞病变结果，连续观察96h后结束试验，MTT染色法测定细胞活性。试验重复3次。用统计软件SPSS13.0对数据进行Probit回归

1.2.4.2 清毒片抗 H1N1的吸附传入作用 将MDCK细胞接种于96孔板，每孔200μL，含细胞2×104个／孔，37℃、体积分数为5%CO2培养24h，细胞长成单层。抛去上清液，分别加入1 250、625、312.5、156.25、78.125、39.062μg／mL清毒片，每孔100μL，每浓度4孔。与细胞预作用6h后，弃去上清液，再加入含100TCID50的病毒液100μL，吸附2h后，弃去病毒液，PBS洗涤2次，加入含20mL／L FBS的细胞维持液，每孔100μL。试验设正常细胞对照组和阳性药组和病毒对照组。逐日观察细胞形态变化，记录细胞病变结果，连续观察96h后终止试验，MTT染色法测定细胞活性。试验重复3次。用统计软件SPSS13.0对数据进行Probit回归分析，计算药物EC50。计算TI＝TC50／EC50，用以评价药物对流感病毒的吸附传入作用。

1.2.4.3 清毒片直接灭活H1N1作用 将 MDCK细胞接种于96孔板，每孔200μL，含细胞2×104个／孔，37、体积分数为5%CO2培养24h，细胞长成单层。弃上清液，将不同浓度的药物的2倍浓度与等体积的200TCID50流感病毒在无菌EP管中混匀，4℃作用6h后再将混合液接种于细胞板。设正常细胞对照组、阳性药及病毒对照。吸附2h后，抛上清液，加入细胞维持液，37℃、体积分数为5%CO2培养箱继续培养。逐日观察细胞形态变化，记录细胞病变结果，连续观察96h后结束试验，MTT染色法测定细胞活性。试验重复3次。用统计软件SPSS13.0对数据进行Probit回归分析，计算药物EC50。计算TI＝TC50／EC50，用以评价药物对流感病毒的吸附传入作用。分析，计算药物EC50。采用治疗指数（treatment index，TI）作为评价指标，用以评价药物对流感病毒的生物合成作用，TI＝TC50／EC50。

2 结果

2.1 HIN1对MDCK细胞的TCID50

细胞感染病毒后出现明显病变，细胞折光性增强，细胞之间拉网、皱缩、呈星状聚集成团、脱落（图1），而对照孔中的MDCK细胞状如梭形或者多边形，H1N1的 TCID50为10-4.12／100μL。

图1 MDCK细胞感染病毒后形态学变化Fig.1 Morphological changes of virus-infected MDCK cells

2.2 清毒片对MDCK细胞半数抑制浓度（TC50）的测定

中药清毒片的不同浓度对细胞的毒性结果，见表1。光镜下观察，清毒片对MDCK细胞的毒性作用表现为：细胞增殖缓慢，折光性发生改变，肿胀变圆，部分细胞贴壁能力下降，破碎，脱落，胞浆内颗粒增多（图2）。

由表1可知，清毒片的TC50≥2 500μg／mL，其细胞存活率很低，清毒片的TC50≤1 250μg／mL，细胞存活率≥75%，金刚烷胺药物浓度为312.5μg／mL时，细胞存活率≥80%，金刚烷胺最大无毒浓度大于312.5μg／mL。SPSS13.0对数据进行Probit回归分析，药物对MDCK细胞的半数抑制浓度TC50为1 596μg／mL。由图2可见，加入1 250μg／mL清毒片组96h后和对照组细胞无差异（图2A，图2B）；而加入2 500μg／mL清毒片组96h后细胞脱落，皱缩成团（图2C）。

表1 药物对MDCK细胞的毒性结果表Table 1 Toxicity of drug to MDCK cells（±SD）

表1 药物对MDCK细胞的毒性结果表Table 1 Toxicity of drug to MDCK cells（±SD）

药物Drugs药物浓度／（μg·mL-1）Drug concentration吸光度值Absorbance value细胞存活率／%Cell survival rate 10 000 0.24±0.03 20 5 000 0.139±0.01 12 2 500 0.197±0.03 17 1 250 0.89±0.02 75清毒片Qingdupian 625 0.93±0.11 79 312.50 0.94±0.01 80 156.25 1.11±0.14 95 78.12 1.18±0.11 100 39.06 1.18±0.14 100 312.50 0.97±0.03 82 156.25 0.96±0.05 81金刚烷胺Amantadine 78.12 1.05±0.02 89 39.06 1.20±0.04 100

图2 清毒片对MDCK细胞毒性作用Fig.2 Toxicity of Qingdupian to MDCKcells

2.3 清毒片抗H1N1作用结果

2.3.1 清毒片抑制H1N1在细胞内合成的测定结果 给药48h后，观察到到病毒对照孔出现明显的CPE（图1A）。各浓度试验孔细胞与病毒对照孔有明显区别，试验孔细胞明显多于病毒对照孔，MTT法测定清毒片对H1N1抑制作用，结果见表2。

由表2可以看出在药物的安全范围内，随着药物浓度的增加，清毒片抗H1N1的抑制率而增强，呈一定的量效关系，其治疗指数为3.5。

表2 清毒片抑制H1N1细胞内合成作用Table 2 Inhabition H1N1intracellular biosynthesis effect of Qingdupian ±SD

表2 清毒片抑制H1N1细胞内合成作用Table 2 Inhabition H1N1intracellular biosynthesis effect of Qingdupian ±SD

药物浓度／（μg·mL-1）Drug concentration 73 625 0.89±0.07 0.82±0.02 0.69±0.05 69 65 63 312.5 0.76±0.06 0.68±0.06 0.58±0.04 58 53 51 411 434 532 3.5 156.25 0.58±0.02 0.60±0.04 0.50±0.04 43 46 44 78.12 0.45±0.04 0.48±0.06 0.42±0.03 32 35 36 39.06 0.30±0.05 0.38±0.02 0.39±0.01 18 27 eutic index 1 250 1.09±0.15 0.94±0.09 0.79±0.09 86 76 OD值OD value病毒抑制率／%Virus inhibitory rate半数有效浓度／（μg·mL-1）Median effective concentration治疗指数Therap 33

2.3.2 清毒片抗H1N1的吸附传入作用的测定结果 给药48h后观察细胞病变，发现病毒对照孔出现明显的CPE，各浓度试验孔细胞明显多于病毒对照孔，MTT法测定清毒片对H1N1抑制作用，结果见表3。

由表3可以看出，清毒片抗H1N1的抑制率随着药物浓度的增加而增强，且呈一定的量效关系，其治疗指数为3.6。

表3 清毒片抑制H1N1吸附、传入细胞作用Table 3 Anti-influenza H1N1adsorption and accession to cells of Qingdupian ±SD

表3 清毒片抑制H1N1吸附、传入细胞作用Table 3 Anti-influenza H1N1adsorption and accession to cells of Qingdupian ±SD

药物浓度／（μg·mL-1）Drug concentration病毒抑制率／%73 625 0.78±0.06 0.72±0.03 0.75±0.08 67 68 68 312.5 0.65±0.06 0.63±0.02 0.62±0.03 55 58 53 404 458 467 3.6 156.25 0.53±0.02 0.45±0.04 0.48±0.04 43 39 39 78.12 0.41±0.04 0.42±0.03 0.38±0.07 32 36 31 39.06 0.33±0.03 0.34±0.15 0.34±0.06 25 28 eutic index 1 250 0.95±0.08 0.91±0.04 0.85±0.03 84 88 OD值OD value Virus inhibitory rate 半数有效浓度／（μg·mL-1）Median effective concentration治疗指数Therap 26

2.3.3 清毒片直接灭活H1N1的测定结果 该试验方法是相应浓度的清毒片和病毒在体外作用6h，然后加入96孔细胞板。48h后发现病毒对照孔出现明显的CPE，各浓度试验孔细胞明显多于病毒对照孔，MTT法测定清毒片对H1N1抑制作用，结果见表4。

由表4可以看出，清毒片抗H1N1的抑制率随着药物浓度的增加而增强，且呈一定的量效关系，其治疗指数为3.4。

表4 清毒片直接灭活H1N1亚型流感病毒作用Table 4 Killing influenza H1N1effect of Qingdupian ±SD

表4 清毒片直接灭活H1N1亚型流感病毒作用Table 4 Killing influenza H1N1effect of Qingdupian ±SD

药物浓度／（μg·mL-1）Drug concentration 75 625 0.75±0.03 0.80±0.10 0.82±0.03 62 65 64 312.5 0.62±0.10 0.64±0.04 0.68±0.06 51 51 52 479 481 461 3.4 156.25 0.57±0.06 0.58±0.05 0.55±0.02 46 46 41 78.12 0.40±0.06 0.41±0.04 0.50±0.06 32 31 37 39.06 0.37±0.04 0.38±0.04 0.37±0.05 29 28 eutic index 1 250 0.87±0.04 0.96±0.05 0.95±0.01 72 78 OD OD value病毒抑制率／%Virus inhibitory rate半数有效浓度／（μg·mL-1）Median effective concentration治疗指数Therap 26

3 讨论

本试验选用H1N1株，结合CPE和MTT法，分析了复方中药清毒片体外抗流感作用。

试验选用的清毒片是由蒲公英、百部等多味中药制成的复方中药片剂，该中药经提取、浓缩等现代工艺提取出咖啡酸、葛根素和苜蓿素等多种成分。咖啡酸具有抗氧化、抗病毒、抗炎和抗菌等作用［4-5］。葛根素具有抗氧化、增强免疫力、抑制肺癌和抗炎作用［6-8］。苜蓿素是豆科植物紫苜蓿的浓缩提取物，研究证实苜蓿素有清热解毒功效，且有抗氧化、抗菌和增强免疫力等多种生物活性［9］。蒲公英局具有清热解毒，消肿散结，利尿通淋之功效，近年来研究发现蒲公英还具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒作用［10-12］。百部味甘、苦，微温，归肺经，具有良好的止咳、化痰、平喘和抗炎功效［13］。从组方和提取成分可以看出，清毒片具有抗病毒，增强免疫力作用，而且可以抗病毒感染带来的炎症，缓解高热和调节肺循环等功能。

从试验方法而言，CPE带有一定的主观性，而MTT法简单直观，二者相结合可定量评估药物抗病毒的活性［14］，提高试验的准确度。

试验结果显示，在清毒片安全浓度范围内（TC50＜1 596μg／mL），抑制作用和药物浓度表现出一定量效关系，清毒片抑制H1N1的能力随药物浓度的增大而增强。本文采用了治疗指数作为对病毒抑制效力的评价，试验结果显示先感染病毒后给药，先给药后感染病毒和药物病毒同时作用3种药物与病毒的作用方式的TI分别为3.5、3.6和3.4，TI都大于常规药物的2.0［15］，说明该药物是低毒高效的，也充分说明清毒片具有明显的抑制H1N1在MDCK细胞内的生物合成作用，阻止H1N1的吸附细胞的作用和直接灭活作用。说明清毒片具有多环节抗H1N1流感病毒作用，但其作用机制目前尚不清楚，有待进一步研究。

［1］Lüscher-Mattli M.Influenza chemotherapy：a review of the present state of art and of new drugs in development［J］.Arch Virol，2000，145，11：2233-2248.

［2］Ji C，Zhang R，Liu J，et al.Review of prevention and treat-ment on influenza A（H1N1）with traditional Chinese medicine［J］.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2010，35（14）：1900-1903.

［3］Wang C，Cao B，Liu Q Q，et al.Oseltamivir compared with the Chinese traditional therapy maxingshigan-yinqiaosan in the treatment of H1N1influenza：a randomized trial［J］.Ann Intem Med，2011，155（4）：217-225.

［4］Bakir S，Ozbay M，Gün R，et al.The protective role of caffeic acid phenethyl ester against streptomycin ototoxicity［J］.Am J Otolaryngol，2013，34（1）：16-21.

［5］Gamaro G D，Suyenaga E，Borsoi M，et al.Effect of rosmarinic and caffeic acids on inflammatory and nociception process in rats［J］.ISRN Pharmacol，2011，30：451682.

［6］王会敏，田 炜，喇孝瑾，等.葛根素，齐墩果酸及其配伍对T2DM大鼠氧化应激和炎症反应的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（15）：174-177.

［7］赵金山，张 燕，延 岩，等.葛根素，核苷酸合剂对小鼠免疫功能的影响［J］.中国医药技术经济与管理，2007，1（7）：64-67.

［8］胡建军，张丹丹，陈俊杰，等.葛根素预处理对LPS诱导RAW264.7细胞活化的影响［J］.中国中药杂志，2012，37（20）：3112-3116.

［9］贾秀娟.苜蓿总黄酮制备工艺及其药效学研究［D］.黑龙江哈尔滨：黑龙江中医药大学，2012.

［10］Schütz K，Carle R，Schieber A.Taraxacum-a review on its phytochemical and pharmacological profile［J］.J Ethnopharmacol，2006，107（3）：313-323.

［11］李华峰.蒲公英花中黄酮类化合物的分离提取及其生物效应研究［D］.山西太原：山西医科大学，2012.

［12］He W，Han H，Wang W，et al.Anti-influenza virus effect of aqueous extracts from dandelion［J］.Virol J，2011，8（3）：538-542.

［13］贾 琳，冯启荣，苏 静.中药百部的主要药效学观察［J］.山东医学高等专科学校学报，2014，36（3）：197-200.

［14］朱 丹，刘华钢，黄慧学，等.金黄Ⅰ号及组方药味体外抗流感病毒作用［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（17）：181-183.

［15］新药（西药）临床前研究指导原则汇编.新药（西药）药理毒理学研究指导原则［M］.中华人民共和国国家卫生部药政局，1993.