贡山厚朴多酚含量的测定及其抗氧化活性研究

李世源，王 韦，戴建辉，蒋孟圆，曾晓丽，李新明，黄相中,2，田 凯

(1.云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南省生物高分子功能材料工程技术研究中心，云南 昆明 650500；2.中国医学科学院 北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京100050)

贡山厚朴多酚含量的测定及其抗氧化活性研究

李世源1，王 韦1，戴建辉1，蒋孟圆1，曾晓丽1，李新明1，黄相中1,2，田 凯1

(1.云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南省生物高分子功能材料工程技术研究中心，云南 昆明 650500；2.中国医学科学院 北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京100050)

采用冷浸提取法、回流提取法及超声提取法对贡山厚朴皮进行提取，对提取物中的多酚类化合物含量进行了测试，结果表明回流提取法的多酚提取率最高，为10.2%. 利用微生物纸片法、DPPH法以及连苯三酚红褪色光度法对贡山厚朴乙醇提取物的抗氧化性能进行了评估，发现该提取物对活性氧(主要是1O2)有中等强度的清除活性，对DPPH自由基和羟自由基有较好的清除活性，其半数清除浓度分别为0.744 mg/mL及1.805 mg/mL.

贡山厚朴；多酚类；抗氧化活性；微生物纸片法

贡山厚朴 (MagnoiarostrataW.W.Smith ) 又名云朴、腾冲厚朴，为木兰科木兰属(Magnolia)落叶乔木，在我国只分布在云南和西藏，通常生长于海拔400～2 800 m的山地阔叶林中[1]. 贡山厚朴在云南和西藏是常用的中药材品种，根据中华草本记载，其主要用于温中化湿，行气消积[2]，目前，还没有对其化学成分研究的相关报道. 植物多酚是一种植物体内的多元酚类次生代谢产物，主要存在于植物体的皮、根、叶、壳和果实中[3-4]. 研究表明植物中多酚类成分具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗微生物、调血脂和降血糖等活性[5-9]. 为了更好的开发利用贡山厚朴，对贡山厚朴中多酚含量及抗氧化性能进行了研究.

1 材料与仪器

贡山厚朴样品于2010年9月采自云南保山，经云南民族大学杨青松副教授鉴定为贡山厚朴(MagnoiarostrataW.W.Smith)，标本存于云南民族大学化学与生物技术学院标本室. 枯草杆菌，实验室提供；玫瑰红，购于昆明化玻站；贡山厚朴样品粉碎备用；没食子酸，北京市通广精细化工公司生产；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，日本东京化成株式会社生产；连苯三酚为北京利德曼公司生产；丙酮、三氯化铁、铁氰化钾，无水乙醇，三氯化铁，铁氰化钾均为分析纯. WFJ-7200型分光光度计，旋转蒸发仪.

2 实验方法

2.1 贡山厚朴中多酚类化合物的提取

取贡山厚朴样品粉碎物3份，每份10 g，分别用冷浸提取法、加热回流提取法和超声提取法进行提取.3种提取方法均是采用工业乙醇连续提取3次，减压浓缩得到浸膏，放于室内使其自然晾干.

2.2 多酚含量的测定

2.2.1 标准曲线的建立

精密称取没食子酸对照品25 mg于50 mL容量瓶中，60%的乙醇溶解并加之刻度，得到0.5 mg/mL的标准品溶液. 精密吸取该溶液2.5 mL于25 mL的容量瓶中，加入60%的乙醇至刻度，配成50 μg/mL的标准品溶液. 参照文献[9]，精密吸取没食子酸对照品溶液0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mL于25 mL比色管中，依次加入0.5 mL的0.100 mol/L三氯化铁，0.50 mL的008 mol/L铁氰化钾0.5 mL的0.10 mol/L盐酸，用60%乙醇定容，得到不同浓度的对照品溶液. 置于暗处15 min后，以蒸馏水为参比液，用WFJ-7200型分光光度计于695 nm处测定吸光度，以没食子酸质量浓度(μg/mL)为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线.

2.2.2 样品的测定

取适宜体积贡山厚朴样品的各种方法提取液，按标准曲线制备操作步骤于695 nm波长进行吸光度的测定，根据标准曲线计算出每种提取方法多酚类化合物的含量及提取率.

2.3 抗氧化活性的测定

2.3.1 微生物法分析样品对活性氧(主要是1O2)的清除能力

1) 实验准备.以无水乙醇为溶剂，配制质量浓度为c0=3.60 mg/mL，c1=1.80 mg/mL，c2=0.90 mg/mL的玫瑰红溶液，避光保存. 同样，配制质量浓度为0.150 mg/mL，0.075 mg/mL，0.038 mg/mL的贡山厚朴的乙醇溶液. 按照体积比1∶1配制不同浓度的玫瑰红和提取物乙醇溶液的混合溶液，玫瑰红与无水乙醇的混合溶液，避光保存. 圆形滤纸片(直径9 mm)，配制细菌培养基.

2) 实验过程.参照文献[10]微生物纸片法，将直径9 mm 的滤纸片浸入混合液片刻后取出，挥尽溶剂后避光保存，将固体培养基加热熔化，冷却至 50 ℃ 左右接入枯草杆菌菌种，搅拌均匀至自然冷却，制成带菌平整培养面，把浸过混合液的纸片放在培养皿中，使其保持一定距离，放妥后用无菌镊子轻压，使紧贴培养基表面，并用 200 W 可见光灯在距培养皿 20 cm 处光照75 min后，再放于 35 ℃ 恒温箱培养 18 h，取出培养皿，准确测量抑菌圈直径. 上述操作除引入、培养细菌外，均在无菌条件下进行.

定义抗氧剂对活性氧表观抗氧化率S：

2.3.2DPPH法[11]分析样品对自由基的清除能力

往10mL比色管中依次加入4mLpH6.88 标准磷酸盐缓冲溶液，4mL0.1777mmol/LDPPH溶液，混匀，再加入一定量质量浓度为 1.00mg/mL的抗氧化剂溶液，用蒸馏水补至刻线，充分混匀，10min后在520nm处测量吸光度. 定义抗氧化剂对DPPH自由基的清除率(K)：

式中：Ai为加抗氧化剂反应后DPPH溶液吸光度；Aj为不加DPPH，只加抗氧化剂及水的溶液的吸光度；Ac为未加抗氧化剂，只加DPPH及水的溶液的吸光度. 按实验方法加入不同体积的抗氧化剂(质量浓度均为1.25mg/mL)，测出Ai, Aj, Ac，据此计算出其相应的自由基清除率(K).

2.3.2 连苯三酚红褪色光度法[11]

往10mL具塞比色管中，依次加入2mLpH9.1 的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液，0.7mL0.0038mol/LEDTA-Fe2+溶液，3.5mL0.000 1mol/L连苯三酚红溶液，0.7mL体积分数0.6%H2O2溶液，蒸馏水补充至刻线后在25 ℃保温反应30min后(加入以上面各溶液时均需摇匀)，测544nm处的吸光度.设不加H2O2时的吸光度为A0，加入H2O2后的吸光度为Ab，则羟自由基产生量可用ΔA=A0-Ab来表示. 在体系中加H2O2之前加入一定量的抗氧化剂，测定其吸光度As，则抗羟自由基氧化率为S：

S=(As-Ab)/(A0-Ab)×100 %.

按实验方法加入不同体积的抗氧化剂(质量浓度均为1.05mg/mL)测出As, Ab, A0，计算出(As-Ab)/(A0-Ab)值，据此再计算出其相应的抗羟自由基氧化率(S).

3 结果与分析

3.1 多酚化合物含量测定结果

3.1.1 用没食子酸为参比标准来衡量样品提取液中的多酚类化合物含量

以没食子酸质量浓度(μg/mL)为横坐标，695nm处吸光度为纵坐标绘制标准曲线，所得的线性回归方程为y=0.374 4x+0.004，R2=0.999 1，结果表明没食子酸在0.4～2.0μg/mL时呈现出良好的线性关系，绘制的标准曲线见图1.

3.1.2 贡山厚朴中多酚含量的测定

冷浸提取法、回流提取法、超声提取法的结果见表1.

表1 贡山厚朴中多酚的冷浸提取、回流提取、 超声提取法含量的测定

从表中可以看出，回流提取法的提取率优于冷浸提取法和超声提取法.

3.2 抗氧化活性的测定

3.2.1 贡山厚朴中多酚类化合物对活性氧(主要是1O2)的清除作用

光敏剂与抗氧剂对表观清除率的影响见表2. 由表2实验数据可以看出，贡山厚朴提取物表现出了良好的活性氧清除能力，在实验所涉及的质量分数范围内贡山厚朴提取物所表现出的抗氧化能力均与其本身质量分数成量效关系，贡山厚朴提取物清除活性氧的能力优于天然抗氧化剂抗坏血酸. 本法重现性好，可作为分析天然抗氧化剂在生物体系中表现的抗氧化性能的一种分析方法.

3.2.2 DPPH法分析样品对自由基的清除能力

按实验方法加入不同质量浓度的抗氧化剂，测出Ai,Aj,Ac, 据此计算出其相应的自由基清除率(K)，结果见图2. 贡山厚朴提取物质量浓度对DPPH自由基的清除率与其使用的量呈正相关，当其体积达到一定时，DPPH自由基清除率达到饱和，不再随质量 mg/mL浓度的增加而增加.

从表中可以看出，贡山厚朴4种不同溶剂提取物对DPPH自由基都有较好的清除能力，其中95%乙醇提取物清除DPPH自由基的能力与标准品没食子酸相近，70%的丙酮提取物清除DPPH自由基的能力相对较弱.

3.2.3 连苯三酚红褪色光度法

按实验方法加入不同质量浓度的抗氧化剂，测出As,Ab,A0, 据此计算出其相应的抗羟自由基氧化率(S)，结果见图3. 贡山厚朴提取物的抗羟自由基氧化率随提取物体积的增大而增大，当达到一定体积的时候，其抗自由基氧化率平缓或基本不再变化，即该抗氧化剂的药效趋势已经达到平衡.

从表中可以看出，贡山厚朴4种不同溶剂提取物对羟基自由基都有较好的清除能力，其中95%乙醇提取物清除羟基自由基的能力与标准品没食子酸相近，70%的丙酮提取物清除DPPH自由基的能力相对较弱.

表2 光敏剂与抗氧剂对表观抗氧化率(S)的影响 %

注：光敏剂为玫瑰红.

表3 贡山厚朴不同溶剂提取物清除DPPH自由基的IC50值 mg/mL

表4 贡山厚朴不同溶剂提取物抗羟基自由基的IC50值 mg/mL

4 结语

本文分别采用冷浸提取法，回流提取法及超声提取法对贡山厚朴皮进行提取，并对多酚类化合物的含量进行了测定，结果显示回流提取法的提取率最高，为10.2%. 同时，采用微生物纸片法、DPPH法及连苯三酚红褪色光度法对贡山厚朴乙醇回流提取物的抗氧化活性进行了评估，结果显示贡山厚朴乙醇提取物对活性氧(主要是1O2)、DPPH自由基及羟自由基均有较好的清除活性，其中对DPPH自由基和羟自由基的清除能力尤其显著，IC50值分别为0.744 mg/mL和1.805 mg/mL.

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(责任编辑 王 琳)

Studies on polyphenol content and antioxidant activity ofMagnoiarostrateW.W.Smith extracts

LI Shi-yuan1,WANG Wei1,DAI Jian-hui1,JIANG Meng-yuan1,ZENG Xiao-li1,LI Xing-ming1,HUANG Xiang-zhong1,2,TIAN Kai1

(1.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Engineering Research Center of Biopolymer Functional Materials of Yunnan,Yunnan Minzu University,Kunming 650500,China;2.State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines,Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050,China)

The barks ofMagnoiarostrataW.W.Smith were extracted with ethanol as a solvent by means of cold extraction, reflux extraction and ultrasonic extraction, respectively, and the polyphenol contents of these extracts were determined with gallic acid as a reference.The results showed that the maximum extraction rate of polyphenol compounds was obtained from the reflux extraction, which was 10.2%.The antioxidant activities of the ethanol extract from the plant were evaluated by the microbiological paper method, DPPH method, and pyrogallol method. The results showed that the extract had some moderate capability in scavenging1O2radicals, and had good capability in scavenging DPPH and hydroxyl radicals with the IC50 values of 0.744 mg/mL,1.805 mg/mL respectively.

MagnoiarostrataW.W.Smith;polyphenol;antioxidant activity;microbiological paper method

2014-04-18.

国家自然科学基金(21262047;838865)；云南省应用基础研究项目(S2012FZ0227)；云南民族大学传统傣药研究创新团队项目；SRT创新性实验项目(2013HXSSRTY06).

李世源(1987-)，男，硕士研究生. 主要研究方向：天然产物化学.

田凯(1971-)，男，硕士生导师. 主要研究方向：天然产物化学与计算化学.

R931.6

A

1672-8513(2015)01-0025-04