上海部分地区母乳核苷特征的初步研究

步 军，孙建华，吴圣楣

(1.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心新生儿科，上海200127；2.贝因美母乳研究中心，上海200127)

上海部分地区母乳核苷特征的初步研究

步 军1，孙建华1，吴圣楣2

(1.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心新生儿科，上海200127；2.贝因美母乳研究中心，上海200127)

目的 通过检测上海部分地区妇女母乳中所含潜在可利用核苷的组成和含量，初步探究中国人群母乳核苷酸的特征。方法 从来自上海部分地区的56名健康哺乳期妇女志愿者中采集母乳样本71份，其中初乳(分娩后3～7天采集)39份，成熟乳(分娩后1～2个月采集)32份。全部母乳样本经过标准酶解处理，将所含的各种核苷酸物质分解为最终代谢产物核苷，再应用高效液相色谱仪逐一检测每个母乳样本中5种核苷浓度，最后相加计算得到母乳中总潜在可利用核苷的含量。结果 在全部母乳样本中均检测出胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷和腺嘌呤核苷，其浓度中位数分别为100mol/L、47mol/L、15mol/L、21mol/L；因为在不到半数的样本(32/71)中检测到低浓度的次黄嘌呤核苷，故将前4种母乳核苷成分之和作为总潜在可利用核苷，其浓度中位数为193mol/L。初乳和成熟乳中的尿嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷浓度存在差异(Z值分别为-2.64、-2.13，均P<0.05)，初乳的总潜在可利用核苷含量高于成熟乳(Z=-2.09，P<0.05)。结论 上海地区母乳总潜在可利用核苷的平均水平和核苷组成与欧美以及亚洲其他地区人群中应用相同方法检测所得结果类似，以胞嘧啶核苷浓度最高，而次黄嘌呤核苷仅在部分样本中存在。

母乳；初乳；核苷酸；核苷

母乳是国际公认的喂养婴儿“黄金标准”，婴儿奶粉的配方通常要求尽可能接近母乳。由于反刍动物乳中的核苷酸含量明显低于人乳，主要以牛乳为原料的婴儿配方乳需要进行核苷酸强化，针对母乳核苷酸特征的研究是母乳营养研究的重要组成部分。自从上世纪60年代早期首次从人类母乳中分离出核苷酸后，有关母乳核苷酸特征的研究报道逐渐增多，但是由于检测方法不同，导致不同的研究结果差异很大。1995年Leach等建立了一种新的方法，以“总潜在可利用核苷”(total potential available nucleoside，TPAN)来全面评价母乳中可被婴儿消化吸收的核苷类物质，应用此方法检测所得欧美人群母乳TPAN平均水平被作为核苷酸的推荐添加量，在部分婴儿奶粉配方中应用至今。但是迄今为止，国内仅有部分研究报道了婴幼儿配方食品如奶粉的核苷酸定量检测方法[1-2]，尚无针对中国人群母乳核苷酸成份和含量特征的研究报道。本研究拟对上海部分地区哺乳妇女母乳中的TPAN水平进行检测，并对母乳所含核苷的特点和影响因素进行初步了解，为进一步深入研究中国人群母乳核苷酸的总体特征打下基础。

1 对象和方法

1.1 研究对象

自2013年2至10月在上海市浦东新区和崇明县根据入选标准募集母乳捐赠者，经过知情同意后成为研究对象，按标准流程采集母乳，并填写乳母基础资料。研究方案经过上海儿童医学中心伦理委员会审核批准。

入选标准：既往身体健康、营养良好的足月分娩产妇，年龄在22～40岁之间，无严重妊娠合并症和感染性疾病史，完全或主要以母乳喂养为主，哺乳期间无发热等疾病和用药史。所生新生婴儿体健，无特殊疾病史。

本研究共募集研究对象56人，采集合格母乳样本71份，包括初乳39份，成熟乳32份；其中15人采集初乳和成熟乳各1份，41人仅采集初乳或成熟乳1份。提供母乳样本的哺乳期妇女年龄为23～34岁，孕龄37+5～41+3周；顺产36人，剖宫产20人，其中初产42人；上海籍27人，非上海籍29人；新生儿出生体重为2 755～4 050g，其中纯母乳喂养45人，混合喂养11人。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集

分别于分娩后3～7天和/或1～2个月采集研究对象母乳样本，采集过程由专人负责操作。本研究以分娩后3～7天采集样本作为初乳组，分娩后1～2个月采集样本作为成熟乳组。

采集和储存方法如下：采集前检查乳房和乳头无异常破损后用温水洗净，轻挤乳房使乳汁自然流出，观察颜色性状无异常后改用吸乳器吸引，直至基本吸空单侧乳房，在10分钟内完成。检查吸出乳汁无血液等异物混入后取10mL置于无菌冷冻离心管中，迅速放入-20℃以下冰箱暂存，之后转送至-70℃深低温冰箱长期储存备检。

1.2.2 样本处理

本研究采用Leach等1995年报道的方法检测单个母乳样本中的核苷浓度。储存母乳在检测前置于室温自然融化后加入1mol/L的NaOH水溶液，密封后振荡，用盐酸调节混合液pH至中性，用蒸馏水稀释至100mL，以5-甲基胞苷(sigma，M-6254)为内标，取9μg加入5mL稀释液中，分别加入磷酸二酯酶P1(sigma，N-8630)19单位、焦磷酸酶(sigma，P-7383)0.4单位、碱性磷酸酶(sigma，P-4252)16单位进行水解，振荡反应48小时，将反应体系转移至25mL容量瓶中，并加入12.5mL磷酸氢二钾溶液，定容至25mL，以0.22μm滤器过滤备用。

1.2.3 固相抽提

将装备有150μL Affi-Gel 601凝胶(Bio-Rad，153-6101)的固相萃取柱用磷酸氢二钾缓冲液(pH10.5)平衡3次，取待检母乳样品1mL过柱，用1mol/L磷酸溶液进行洗脱，再用0.22μm过滤器过滤后进样检测。

1.2.4 样本检测

本研究采用Agilent HP1100高效液相色谱质谱仪(HPLC)进行检测分析，选择SB-C18 5μm 150×2.1mm色谱柱为固定相，以乙酸钾和己烷磺酸钠(20:1)以及乙腈分别为流动相，流速每分钟0.2mL，柱温24.5℃，核苷检测波长设定为255nm。

1.2.5 数据计算

每种核苷的校准曲线通过计算系列稀释浓度的5种核苷标准品(sigma：U-3750；C-9505；I-4125；G-6752；A-9251)和固定浓度的内标5-甲基胞苷面积比值构成。通过HPLC分析测得的各种核苷内标面积比值进行计算得到该种核苷浓度，母乳中的各种核苷浓度之和即为母乳TPAN含量。

1.2.6 统计学分析

所有数据通过SPSS 19.0软件进行统计学分析。所有检测母乳样本中各种核苷含量数据均为非正态分布，故以中位数、四分位间距(M，Q75-25)表示；初乳和成熟乳核苷含量的差异采用两组独立样本的Mann-Whitney检验进行比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 母乳核苷类物质水平

在所有的母乳标本中均检测到除次黄嘌呤核苷(I)以外的4种核苷，而I仅在不到半数的样本中(32/71)检测到低浓度的含量，故未纳入统计分析。母乳中的胞嘧啶核苷(C)浓度为(100，56) μmol/L；尿嘧啶核苷(U)浓度为(47，29)μ mol/L；鸟嘌呤核苷(G)浓度为(15，19) μmol/L；腺嘌呤核苷(A)浓度为(21，16) μmol/L；4种核苷浓度合计为TPAN浓度，经过计算得出TPAN浓度为(193，74) μmol/L。

2.2 初乳和成熟乳核苷类物质水平的比较

初乳组与成熟乳组4种核苷和TPAN的浓度进行比较，结果显示两组之间的TPAN浓度差异存在统计学意义(P<0.05)，初乳浓度高于成熟乳；4种核苷中U和G的浓度差异均有统计学意义(均P<0.05)，见附表。

附表 初乳和成熟乳核苷浓度的比较结果[(M，Q75-25)，mmol/L]

Table Comparison of nucleosides concentration between colostrum and mature [(M，Q75-25)，mmol/L]

3 讨论

3.1 母乳核苷酸的生理作用和成分特征

核苷酸(Nucleotides)及其相关代谢产物在许多生物学过程中起着关键作用，体内核苷酸的来源既可为内源性生化途径，也可为外源性营养途径。由于外源性核苷类物质的供给对于维持人体部分组织器官的正常功能具有重要意义，因此核苷酸和其化合物被称为“条件”必需或半必需营养素，尤其对处于快速生长发育阶段的新生婴儿显得更为重要。较早的研究已发现核苷酸对于婴儿整体免疫和肠道局部免疫、营养代谢、抗感染等多方面具有促进作用[3-4]，近年以来还发现其对于婴儿睡眠节律的形成有一定作用[5]，但是未证实婴儿期核苷类物质的摄入和儿童早期过敏性疾病相关[6]。在膳食中进行强化是补充婴儿外源性核苷酸的主要途径，但是添加的种类和适宜量尚不明确，而母乳中的核苷酸谱和含量则成为主要的参考依据。

上世纪80年代起国外开始应用高效液相色谱法(HPLC)研究母乳所含核苷酸和核苷类物质，由于母乳中核苷类物质来源的多样性和不稳定性，母乳核苷类物质来源于细胞内和细胞外，除了游离状态的核苷酸和核苷以外，还包括了核苷酸加合物(如NAD和UDP糖)和主要为RNA的核苷酸聚合物等，同时母乳中所包含的生物活性酶对于核苷酸具有分解作用，因此不同的处理和评价方法导致不同的研究结果差异很大。虽然已有研究应用反向高效液相色谱-串联质谱法和毛细管电泳法测定婴儿配方乳中的核苷酸和核苷含量[7-8]，但是尚无应用于母乳研究的报道。Leach等的检测方法模拟核苷酸在人体消化道的吸收过程，首先通过酶解法将母乳所含包括游离核苷、游离核苷酸、核苷酸加合物(如NAD和UDP糖)和主要为RNA的核苷酸聚合物在内的所有核苷物质分解为单体核苷，再通过HPLC技术测定各种核苷含量，并将其总和称为TPAN。与以往的检测指标相比，TPAN是一个反映母乳中总体核苷酸含量的综合指标。Leach等检测了采集自3个欧洲国家100个哺乳期妇女不同泌乳阶段的母乳汇集而成的16个样本池，其结果显示所测母乳的TPAN含量为189±70mmol/L(范围82～402μmol/L)，母乳中不同核苷含量差异大，平均含量以胞嘧啶核苷为最高，而次黄嘌呤核苷仅在一个样本池中检出。2003年Tressler等报道了亚洲妇女母乳中的TPAN含量，其从香港地区、菲律宾和新加坡的135名健康乳母中采集了160份4个不同阶段的母乳，每10份样本汇集成1个样本池，应用Leach等的方法进行检测，结果显示TPAN的平均浓度为203μmol/L，其中初乳、过渡乳、早期和晚期成熟乳的平均浓度分别为171.9μmol/L、208.1μmol/L、221.6μmol/L和210.6μmol/L，不同国家之间无明显差异。

以上研究均以多个样本汇集成的样本池为检测对象，虽然也可反映母乳核苷酸的总体水平，为了更好地反映人乳核苷酸含量的个体差异，本研究采用了单个母乳样本检测法，结果显示TPAN浓度中位数和上述研究结果相类似。在母乳核苷谱组成上也以C为主，I的浓度最低，在超过半数的样本中未能检出。但是各种核苷的浓度中位数和上述研究报道的平均浓度有所差异，C和U的浓度较高，而G和A的浓度较低，而且不同个体样本之间各种核苷浓度的差异明显。这与本研究测定个体母乳样本，而上述研究测定多样本混合的母乳池有关。在不同阶段母乳TPAN水平的比较上，本研究结果和前述研究不同，初乳的TPAN水平高于成熟乳。为了易于操作，本研究将初乳的采集时间定为出生后3～7天，此与标准的初乳定义有所不同，多种因素均可能影响核苷的测定结果，因此需要扩大检测样本量以进一步评估。

3.2 母乳核苷酸研究的问题和展望

本研究首次报道了中国大陆地区母乳所含核苷的总体含量和成分特征，发现上海地区母乳TPAN的平均水平和核苷组成与欧美以及亚洲其他地区人群中应用相同方法检测所得结果相类似，以胞嘧啶核苷浓度最高，而次黄嘌呤核苷仅在部分样本中存在。

本研究采用的方法除母乳样本的酶解时间有所延长以外，基本与Leach等的方法相一致，因为条件所限，本研究未对该检测方法进行方法学验证。由于母乳核苷酸的多元性和影响因素较多，母乳样本收集流程、样本处理和检测的标准化也可能影响最终结果，迄今为止尚未得到公认的母乳核苷酸评价标准和方法。除了Tressler等的研究基本采用Leach等的TPAN评价法外，Thorell等(1996年)的研究采用不同的方法也得到了相似的结论，但是Liao等[9]报道的台湾地区母乳核苷酸特征却存在较大的差异，因此需要通过进一步的方法学论证研究选择最佳的检测方法，并扩大检测样本的来源和数量以正确评估中国人群母乳核苷酸的含量和影响因素，为最终建立符合中国人群特点的婴儿食品如配方奶粉的核苷酸添加标准奠定基础。

[1]俞莎,陈晓春,潘洪峰,等.UPLC-MS/MS法测定婴幼儿配方乳粉中五种核苷酸的研究[J].营养学报,2010,32(2):187-189.

[2]郝岩平,张秋梅,王象欣.婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸的测定方法[J].中国乳品工业,2011,39(4):48-52.

[3]Yau K I,Huang C B,Chen W,etal.Effect of nucleotides on diarrhea and immune responses in healthy term infants in Taiwan[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2003,36(1):37-43.

[4]Hawkes J S, Gibson R A, Roberton D,etal.Effect of dietary nucleotide supplementation on growth and immune function in term infants:A randomized controlled trial[J].Eur J Clin Nutr,2006,60(2):254-264.

[5]Arslanoglu S, Bertino E, Nicocia M,etal.WAPM Working Group on Nutrition:Potential chronobiotic role of human milk in sleep regulation[J].J Perinat Med,2011,40(1):1-8

[6]Timmermans M J, Daqnelie P C, Theunisz E H,etal.Dietary nucleotide and nucleoside exposure in infancy and atopic dermatitis, recurrent wheeze, and allergic sensitization[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2015,60(5):691-693.

[7]Gill B D, Indyk H E, Manley-Harris M.Analysis of nucleosides and nucleotides in infant formula by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Anal Bioanal Chem,2013,405(15):5311-5319.

[8]Rodriguez-Gonzalo E, Dominguez-Alvarez J, Mateos-Vivas M,etal.A validated method for the determination of nucleotides in infant formulas by capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry[J].Electrophoresis,2014,35(11):1677-1684.

[9]Liao K Y, Wu T C, Huang C F,etal.Profile of nucleotides and nucleosides in Taiwanese human milk[J].Pediatr Neonatol,2011,52(2):93-97.

[专业责任编辑：古桂雄]

低出生体重和先兆子痫可能与家族史相关

低出生体重和先兆子痫与家族史有关，这是2015年2月在圣迭戈(加利福尼亚州)举行的母胎医学学会(怀孕会议)年会上展示的一项以色列研究成果。比尔谢瓦的索罗卡大学医学中心的医师对1991至2012年间在医学中心出生的2 315位母亲、女儿和孙子(女)的三元组数据进行了分析。分析结果表明，如果母亲低出生体重，尽管调整了年龄和胎盘病理等因素之后，对于其后代低出生体重仍是一个重要的预测因子；对于先兆子痫也是同样的结果，尽管调整了其他影响因素之后，这种情况也再次出现在后代中。研究报告作者Yehonatan Sherf表示：“母系家族有低出生体重或先兆子痫的孕妇应该被告知关于这些后果的情况，并对其进行严密监控”，从而使这些并发症在早期阶段就可以被检测到。

Primary study on characteristics of human breast milk nucleosides in some areas of Shanghai

BU Jun1, SUN Jian-hua1, WU Sheng-mei2

(1.DepartmentofNeonatology, 2.BeingmateBreastMilkResearchCenter,ShanghaiChildren’sMedicalCenterAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Objective To explore the characteristics of human breast milk nucleotides in Chinese population by measurement of total potential available nucleoside (TPAN) in breast milk of women in some areas of Shanghai. Methods Totally 71 milk samples were collected from 56 healthy lactating women volunteers in Shanghai, including 39 colostrum samples (3 to 7 days after birth) and 32 mature milk samples (1 to 2 months after birth). All samples were processed by standard methodology. Nucleotides were enzymatically hydrolyzed to their constituent nucleosides, and free and hydrolyzed nucleosides were then measured by HPLC to yield TPAN value. Results The medium values were 100mol/L for cytidine, 47mol/L for uridine, 15mol/L for guanosine, and 21mol/L for adenosine, and they were found in all of the samples. Less than half of milk samples (32/71) contained inosine with low concentration, and the accumulation of the above four nucleotides were considered as TPAN with medium value of 193mol/L. There were differences in the value of uridine and guanosine between colostrum and mature milk (Zvalue was -2.64 and -2.13, respectively, bothP<0.05), and the TPAN value of colostrum was higher than mature milk (Z=-2.09,P<0.05).Conclusion The average TPAN level and the composition of nucleosides of breast milk from lactating women in Shanghai are similar to these in population in European, American and other Asian measured by the same methods. Cytidine is the predominant nucleoside in human milk, and inosine is found only in some samples.

breast milk；colostrum；nucleotides；nucleoside

2015-01-28

步 军(1969-)，男，副主任医师，主要从事新生儿临床和营养的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.03.004

R174

A

1673-5293(2015)03-0409-03