基于3D碳纳米材料固载AChE应用于毒死蜱的检测

张 宇，夏 志，刘 刊，李明伟，田亚婷，袁 玲，杨玉莲

（贵州工程应用技术学院 化学工程学院，贵州省化学化工实验教学示范中心，贵州 毕节551700）

毒死蜱属有机磷农药杀虫剂，被用于水稻、小麦、蔬菜、水果等多种咀嚼式害虫的防治，在农业生产和生活中应用十分广泛[1－2]。但毒死蜱进入人体会产生很大的伤害[3－5]。因此，毒死蜱一直是食品和农业环境中农药残留检测的重点。传统的毒死蜱残留检测方法主要有气相色谱法[6]、液相色谱法[7]以及其与质谱的联用[8]等技术，这些方法具有分析灵敏度高、检测限低和定性定量准确的优点，但所需的仪器设备大型昂贵、样品前处理过程繁琐、检测时耗久和不能实现在线检测。且常规检测中的提取、净化、浓缩及检测等过程中，每一步骤所用的操作方法、硬件设施、人员技术熟练程度乃至实验室的管理水平等都对测定结果产生较大的影响，从而限制了其应用前景，不能快速有效地在野外进行实时检测。

生物传感器技术作为近年来检测农药残留的新方法，相比传统的检测方法具有更好的准确性和特异性，有选择性好、响应快、操作简便、价格便宜、样品处理要求较低、可微型化、便于利用计算机收集和处理数据以及不会或很少损伤样品或造成污染等特点。

生物传感器的响应性能很大程度依赖于传感器的构建，只有设计构造出性能优异的传感器才有实际应用的价值和意义。碳纳米材料具有化学稳定性高、比表面积大、导电性和生物相容性优异等优点，能够为电化学反应提供充足的活性位点[9－10]，石墨烯（GO）因其表面丰富的亲水基团和其特殊的结构，可以作为分散剂分散碳纳米管（CNTs）制备出水溶性和分散性较好的碳纳米管－石墨烯（CNTs－GO）纳米复合物。并将其作为载体构建以乙酰胆碱酯酶（AChE）为催化活性中心的有机磷农药残留检测传感器，促进有机磷农药残留检测实现简单、实时、在线和快速检测。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

乙酰胆碱酯酶（AChE，TypeC3389－500UN，425.94units／mg，Sigma－Aldrich 公 司），氯 化 乙 酰胆碱（阿拉丁试剂），毒死蜱标品（湖北仙隆化工股份有限公司），碳纳米管（CNTs），石墨烯（GO）（南京先锋纳米科技股份有限公司），氯化钾、磷酸和氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司），Al2O3粉末（上海辰华试剂厂）；试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

电化学工作站（上海辰华仪器有限公司），扫描电镜（S－4800，Hitachi，日本），精密型酸度计（上海雷磁仪器厂），5L、10L、25L、50L 微量进样器（宁波市镇海玻璃厂）。

1.2 纳米复合材料的制备

将1∶1的CNTs和GO 水溶液置于超声波中，利用超声波的震荡作用，使两种物质分散并融合，最后得到混合均匀的CNTs－GO 纳米复合物。

1.3 电极的前处理及传感器的制备

电极修饰前，在麂皮上用粒径0.05m 的Al2O3粉悬浊液将玻碳电极（GCE）抛光成镜面，再用二次水清洗干净，分别在乙醇和二次水中超声清洗5min，室温下自然晾干。然后先将CNTs－GO 的纳米复合物滴涂在电极表面，再将AChE 固定在纳米复合材料表面，在冰箱内静置24h，让其晾干，即制得AChE／CNTs－GO／GCE。同法制备CNTs／GCE和GO／GCE。

1.4 测定方法

试验均采用三电极系统：修饰的GCE为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，铂电极（Pt）为对电极，所有试验均在室温下进行。具体的电极构造及实验原理见图1。

图1 三电极系统电极构造及原理Fig.1 The schematic diagram of the electrode structure and principle

1.4.1 底物最适浓度的测定 改变底物浓度对酶纳米复合结构生物传感器的反应速率有很大影响。试验采用循环伏安法考察传感器在反应体系中对底物氯化乙酰胆碱浓度的选择，在反应体系中，逐渐增加氯化乙酰胆碱的量，然后再逐一进行循环伏安扫描。

1.4.2 pH及孵育时间的优化 酶的活性受pH值影响较大，过酸或过碱都会影响AChE 酶蛋白的构象。同时pH 还会影响氯化乙酰胆碱与AChE的解离状态、酶与底物形成的中间产物解离速度以及酶活性。因此，采用计时电流法考察传感器在反应体系中pH 值的最优值。分别配制0.1mol／L、pH 4.0～8.5的PBS，测定底物氯化乙酰胆碱的响应电流。

毒死蜱与AChE 作用使酶失活需要一定的时间才能达到平衡，这段时间被称为抑制时间。只有当酶被一定浓度毒死蜱抑制完全后才能对毒死蜱的抑制作用进行检测，进而确定其浓度。对抑制时间进行选择，采用循环伏安法考察传感器在1.43 μmol／L毒死蜱中抑制不同时间的响应。

1.4.3 传感器对毒死蜱的电化学响应 分别向反应体系中加入事先配置好的毒死蜱标准液，抑制合适时间后，加入底物，反应彻底后利用循环伏安法测定修饰电极对农药毒死蜱的响应。

2 结果与分析

2.1 CNTs和CNTs－GO的微型形貌

从图2－a中可见，单纯的CNTs管径分布均匀，相互缠绕在一起，呈明显的卷曲状，有团簇现象。而加入GO 后，表面存在弯曲褶皱，呈现石墨烯的固有特征，CNTs从GO片层中穿过，又由于GO 与CNTs有较强的π－π键作用，由此形成一种3D 立体的疏松多孔夹层结构（图2b），这种结构能使电极的比表面积大幅提升，能为电化学反应提供充足的活性位点和反应场所，促进电子传递，从而提高整个纳米复合材料修饰电极的催化性能。

图2 碳纳米管（a）和碳纳米管／石墨烯（b）的微型形貌Fig.2 SEM morphology of CNTs（a）and CNTs－GO（b）

2.2 电化学表征

从不同材料修饰的玻碳电极在0.1mol／L、pH 7.5的磷酸缓冲液（PBS）中的循环伏安曲线（图3）看出，裸玻碳电极（a曲线）的氧化电流强度很小，且无明显的出峰；b曲线氧化电流强度有了明显增大，且在－0.1V 左右有一对明显的氧化还原峰，为碳纳米管的特征峰[11－12]；虽然GO 由于具有丰富的亲水基团水溶性较好，但c曲线导电性能无还原石墨烯强，电流强度较b曲线有所下降；d曲线电流强度比c、b曲线强，这是因为GO 的加入大幅度提升了电极的比表面积，降低了CNTs的团聚，显著提高了电极的电化学性能。

图3 不同修饰电极的循环伏安曲线Fig.3 Cyclic voltammetry curve of different modified electrodes

2.3 反应体系底物的最适浓度

从图4看出，0.6V 左右峰电流值有明显变化，且峰电流值随浓度的增大而降低。底物浓度在0.5～8.5μmol／L 时，氧化峰电流值随浓度的增大而降低，但浓度大于8.5μmol／L 时电流反常，而且变化值很小。为避免底物浓度过小导致电极响应不明显，又不致使底物浓度过大而导致酶的活性中心被底物全部占据从而对抑制剂不敏感，引起检测下限升高，选择最适浓度为8.5μmol／L。

2.4 pH及孵育时间的优化

由图5（A）可知，当pH 值在5.0～7.5时，响应电流逐渐增大，pH＝7.5时响应电流最大，pH 大于7.5时，响应电流反而减小。因此，选择0.1mol／L pH 7.5的PBS为测试底液。

由图5（B）可知：在1～5min，随着孵育时间的增加，峰电流不断下降；5 min后，随着孵育时间的增加，峰电流的变化平缓，说明峰电流进入平台期，直至试验结束，电流值变化不大，说明毒死蜱与AChE作用使酶失活已经达到平衡，可以对酶的抑制效果进行检测。所以，确定毒死蜱对AChE 的最佳孵育时间为5min。

图4 修饰电极对氯化乙酰胆碱的循环伏安响应（A）和氯化乙酰胆碱的浓度与峰电流之间的关系（B）Fig.4 Cyclic voltammetry response diagram of the modified electrode to acetylcholine chloride（A）and The relation between different acetylcholine chloride concentration and peak current（B）

图5 pH 值（A）和抑制时间（B）的修饰电流Fig.5 Effect of pH （A）and restricted time（B）on modified electrode

2.5 传感器对毒死蜱的电化学响应

随着毒死蜱的加入，AChE的催化活性被抑制，导致电流下降（图6A），且电流下降的程度与溶液中的抑制剂毒死蜱的浓度成正比。由电流的抑制率公式[13]：抑制率I%＝（I0－In）／I0（I%为电流抑制率，I0和In分别为抑制前后的峰电流值）处理数据得到（图6B），根据抑制率和浓度构建酶传感器检测毒死蜱的抑制率曲线，农药抑制率与浓度在一定范围内存在线性关系。在0.71～5.70μmol／L 的范围内抑制率回归方程为I%＝2.375 8c＋16.918，相关系数R2＝0.809 8；在5.70～71.13μmol／L 的范围内抑制率回归方程为I%＝0.055 3c＋28.682，相关系数R2＝0.964 9。检出限达0.23μmol／L，说明，该传感器检测毒死蜱时具有较高的灵敏度，可利用毒死蜱对胆碱酯酶的抑制作用检测毒死蜱的浓度。

2.6 实际样品的测试

采用传感器对毕节流仓河水进行检测结果（表）表明，回收率在96%～102%，说明该传感器可用于实际样品的检测。

图6 修饰电极对不同浓度毒死蜱（0.71，1.43，2.90，4.27，5.70，14.26，42.68，71.13mmol／L）的循环伏安响应（A）及相对应的抑制曲线（B）Fig.6 Cyclic voltammetry response diagram of modified electrode to Chlorpyrifo with different concentration including 0.71；1.43；2.90；4.27；5.70；14.26；42.68and 71.13mol／L（A）and corresponding inhibition curves（B）

表 水样中有机磷农药的检测（n＝5）Table Detection of Organic phosphorus pesticide in water samples（n＝5）

3 小结与讨论

电化学传感器检测有机磷农药开辟了电化学与分子生物学的新领域，为生命科学的研究提供一种全新的方法。生物传感器因其快速、高效、简便等特点，在检测有机磷农药方面有着传统方法不可代替的优势。将GO－CNTs纳米复合物作为载体构建以AChE为催化活性中心的农药残留检测传感器能更准确地对毒死蜱进行检测，在最优条件下，在0.71～71.13μmol／L具有良好的线性关系，最低检出限达到0.23μmol／L，大大提高了传感器的灵敏度，能对毒死蜱进行快速灵敏的检测、前处理简单、检测时间短、所需仪器设备简单、可及时对市场上含残留有农药的蔬菜进行检测，将一部分农药残留量超标的蔬菜控制在交易市场之外，尽量减少对人们的伤害。其次，这种方法的检测费用低，可以被广泛利用，在目前情况下，酶抑制法是蔬菜市场快速测定蔬菜中毒死蜱农药残留的一种有效可行的方法。

由于酶传感器技术还处在不断发展和完善的过程中，因此，存在一定的不足，还有很多问题有待解决。如保持固定化酶的活性、高度专一性、提高传感器的稳定性和使用寿命等问题还有待解决。但随着技术的不断成熟，AChE 传感器将会成为检测毒死蜱残留最简便、有效的方法。

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