云南文山竹丛枝病的检测及16S rDNA 片段序列分析

骆帝谕?王连春

摘 要：用植原体16S rRNA基因通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2，对表现丛枝的竹子植株总DNA进行直接PCR及巢式PCR扩增，得到长1.2 kb的目的片段。经过克隆测序比较分析，结果表明其属于16Sr I-B亚组。

关键词：云南；竹丛枝；16s rDNA

竹是禾本科竹亚科Bambusoideae植物的总称。竹子是具有极高的观赏性的一种经济作物，其形态优美，常作为景观观赏、道旁植被、公园植物[1]。云南文山州地处云贵高原东南部，属于亚热带气候，该地区水热资源较丰富，年温差小，日温差大，比较适合竹子的生长。

竹丛枝病又名“扫帚病”，“竹簇叶病”，在韩国、印度以及中国许多省市均有报道[2-4]。感病植株生长势弱，出笋减少，严重的病竹常常会枯死，竹材质量严重下降。随着竹林面积迅速扩大，该病的危害越来越严重，已成为竹子上最常见的严重病害之一[1，5]。早期的研究认为竹丛枝病是有瘤座菌[Aciculosporium take Miyake，Balansia take（Miyake） Rlara]真菌引起的病害[6]。然而许多植物丛枝病均被证实由植原体引起，随着分子生物学研究技术的进步，通过PCR扩增可以快速鉴定植物材料中是否含有病原，本研究采拟采用PCR技术对文山表现丛枝症状的竹子植株进行植原体分子检测，并对扩增得到的16S rDNA片段进行克隆及测序，并与已知的竹丛枝植原体16S rDNA进行序列同源性比较，确定其植原体株系的分类地位，并初步比较其各株系间的差别。

1 材料与方法

1.1 材料来源与主要试剂

竹子材料采自云南文山州广南县冷水沟，海拔1200m。材料于-80℃保存备用。基因组DNA提取试剂盒来自百泰克生物技术有限公司，DNA Marker、Taq酶、Amp、IPTG等试剂购自北京金式金生物科技有限公司。pMD19-T购自宝生物TaKaRa。

1.2 材料总DNA提取

取材料0.5g，剪碎放于研钵中，加入液氮，研磨3-5次，直至成细粉状。参照植物基因组DNA提取试剂盒的方法，提取植株总DNA干燥后溶于EB buffer溶液，于-20°C下冷冻保存备用。

1.3 PCR扩增

选用植原体16S rDNA通常用的引物P1/P7和R16F2n/R16R2进行巢式PCR扩增：25μL体系，10 x Easy Taq Buffer 2.5μL ，dNTP 2μL，引物各0.5μL，Easy Taq Polymerase 0.25μL，DNA 模板1μL。PCR反应程序：预变性94℃ 5min，变性温度94°C 1min，复性温度48°C 1 min，延伸温度72°C 2 min，总共30次循环，总延伸10min。巢式扩增程序为：预变性94℃ 5min，变性温度94°C 1min，复性温度55°C 1min，延伸温度72°C 1min 30 s，总共35次循环。扩增产物在1﹪琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样3uL，用凝胶成像系统观察并拍照记录。

1.4 PCR扩增产物的纯化、克隆、酶切鉴定以及序列测定

在紫外透射仪上切下含目的PCR产物琼脂块，用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（昆明硕阳科技有限公司），琼脂块凝胶上回收目的片段，在含有IPTG和X-gal的LB筛选平板上挑取白色菌落摇菌培养12小时，提取重组质粒DNA ，经过酶切和跑电泳检测之后，筛选出正确的质粒DNA经过克隆送去上海生工生物技术有限公司进行测序。

1.5 16S rDNA核酸序列同源性比较和酶切位点分析

采用DNAMAN 6.0、MEGA5.0等生物软件，分析所测序列的含量，将测定到的序列与植原体组中各个具有代表性植原体的 16S rDNA基因序列进行比较。

2 结果与分析

2.1 感病植株的症状表现

感病植株明显表现为丛枝症状，枝条先端枝条簇生，簇生节间变短，分枝增多，丛生成鸟巢状，叶片呈现黄化（图1）。

图1 感病植株丛枝症状图

2.2 PCR扩增结果

感病植株通过液氮提取总DNA，经巢式PCR 扩增，结果获得大小约1 200 bp 的16S rDNA 片段（图2），片段大小与预期大小相符，而健康对照未出现特异扩增带。说明该丛枝样品中确有植原体存在。

图2 PCR 电泳检测图（M：Maker； 1为健康植株；2，3 为巢式PCR扩增的两个不同重复）

2.3 16S rDNA序列分析

将扩增到的1 200 bp左右大小的特异片段经割胶纯化后，连接pMD19-T，转入大肠杆菌DH5α，涂板后挑取重组克隆，经PCR验证正确的克隆子送上海生工测序， 结果表明：16S rDNA 基因扩增片段含有1 246个核苷酸，G + C 的含量为47.11 % ，符合植原体基因组G + C含量。将本研究中所获得分离物命名为bamboo witches-broom phytoplasma ，BWB-WS。从Genbank中调取竹子丛枝植原体11条序列，并选取Tomato big bud （BB） （AY180955 ）16S r I-A，Paulownia witches-broom phytoplasma （HM146078） 16S r I-B作为参照序列，Acholeplasma laidlawii（M23932）作为外群（表1），利用MEGA 5 生物软件进行植原体16S rDNA序列进行核酸同源性比较，同源性比较结果表明该研究获得的植原体与BWB-YA，BWB-TA 同源关系最近，为99.7%，与已报道的云南另外一个株系BWB3同源关系为99.2%。与海南的3个株系BWB-Hn1，Hn2，Hn3同源关系较远，在 89.4～89.6%之间。经在线工具iphyclassifier

根据16S rDNA序列建立的系统进化树 （图2）表明：BWB –WS 和已经报道的竹丛枝韩国、杨凌、山东等8个株系聚在一簇，并且和参照序列Paulownia witches-broom phytoplasma （HM146078）聚类在一个大支，同属16S r I-B 亚组，和参照序列Tomato big bud （BB） （AY180955 ）16S r I-A亚组的成员明显区别开，和海南的3个株系不属于同一个组。在地域上，除了海南3个株系属于植原体16S r II-A 组外，本研究文山分离物和其他地区的无明显地域差别。

图2基于16S rDNA片段碱基序列建立的竹丛枝植原体系统进化树

3 讨论与结论

竹子丛枝病，在我国竹产区广泛分布，且有不断加重的趋势。早期研究有认为瘤座菌确能引起竹类丛枝病，该竹子发病是否由真菌和植原体共同侵染引起，尚不得而知。本研究用分子生物学方面进一步证实了云南文山竹丛枝内植原体的存在，并初步确定了其分类地位。

我国邱并生、蔡红、刘永光等对分别采自北京、广东、云南、山东的凤尾竹丛枝（femleaf hedge bamboo witchesbroom，FHBWB）、刺竹丛枝（chinese thorny bamboo witchesbroom，BwB）等竹子材料进行了植原体16S rDNA 片段扩增及RFLP分析，结果表明它们均属于翠菊黄化（16S r I ）组。本文对采自云南的文山的竹丛枝植原体16S rRNA基因部分序列测定及比较结果也显示该株系属于16S r I组，与前面研究报道结果一致，这也表明，不同来源，不同品种的竹子上均可感染该组植原体，不受地域品种的限制。经在线分析工具iphyclassifier

该研究获得的植原体分离物属于16S r I-B亚组，本研究中的材料在云南文山地区尚属首次发现。

参考文献

[1] 梁惠凌，黄仕训，蒋能等.广西竹子主要病虫害的发生和综合防治对策[C].//第六届生物多样性保护与利用高新科学技术国际研讨会论文集.2006.

[2] JUNG H Y，CHANG M U，LEE J T，et a1.Detection of “Candidatus phytoplasma asteris”associated with henon bamboo witchesbroom in Korea[J].J Gen Plant Pathol，2006，72（4）：261-263.

[3] 庄启国，刘应高，潘欣等.四川斑竹丛枝病植原体检测及16S rDNA片断序列分析[J].四川农业大学学报，2005，23（4）：417-419，431.

[4] 刘永光.山东省桑萎缩、枣疯病、竹丛枝及三种新植原体病害分子检测与鉴定[D].山东农业大学，2009.

[5] 杨永刚，吴小芹.竹丛枝病病原研究进展[J].浙江农林大学学报， 2011，28（1）：144-148.

[6] 朱熙樵，黄焕华.竹丛枝病的研究I症状、病菌分离和接种试验[J].林业科学，1988，24（4）：483-487.

作者简介

骆帝谕（1990-），男，云南文山，本科生，研究方向：植物病理学。

王连春，玉溪师范学院资源与环境学院。