紫山药色素醇提物的抗氧化活性研究

霍艳荣　高前欣　王振宇

摘要[目的] 采用体外试验的方法测定紫山药色素清除自由基的抗氧化性功能。[方法] 以乙醇为溶剂提取紫山药色素，AB-8大孔树脂制备纯化物，采用清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH法、测定还原力等体外试验方法研究其对自由基体系的抗氧化作用、还原力大小。[结果]试验表明，紫山药色素具有良好的抗氧化能力，纯化后抗氧化能力增强。纯化后清除羟自由基的IC50略低于VC，当纯化物浓度高于0.7 mg/ml时，其清除率高于VC；当纯化物浓度达到5.0 mg/ml时，对超氧阴离子自由基的清除率为95%，高于VC（92%）；浓度高于2.0 mg/ml时，对DPPH·的清除率与VC相当。[结论]研究可为拓展紫山药色素的应用领域提供理论依据，为天然抗氧化剂的开发人员和食品行业的技术人员提供新的参考资料。

关键词紫山药色素；醇提物；自由基；抗氧化

中图分类号S632.1文献标识码A文章编号0517-6611（2015）07-299-03

Study on Antioxidant Activity of Ethanol Extracts from Purple Yam Pigment

HUO Yan-rong1，2， GAO Qian-xin2， WANG Zhen-yu1，3*

（1. Forestry College， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. Zhejiang Agricultural and Forest University， Hangzhou， Zhejiang 311300； 3.Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Abstract[Objective] The function of antioxidation and scavenging free radicals of purple yam pigment was determined by using in vitro methods. [Method] Ethanol was used to extract purple yam pigment and then purified with AB-8. Hydroxyl radicals， oxygen free radicals， DPPH radicals eliminate and reducing capacity was studied by in vitro methods. [Result] The results showed that purple yam pigment has good antioxidant ability and enhanced after purification. IC50 of ·OH was slightly lower than VC and higher than it when the concentration was more than 0.7 mg/ml. The oxygen free radicals eliminate ratio was 95%， higher than VC（92%） when it was 5.0 mg/ml. The DPPH· eliminate ratio was same as VC when the concentration higher than 2.0 mg/ml. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for expanding application field of purple yam pigment， and provide reference data for natural antioxidants developers and technical personnel of food industry.

Key wordsPurple yam pigment； Alcohol extracts； Free radicals； Antioxidant

紫山药也称“紫人参”，又名薯蓣和长芋，属薯蓣科，以其肥大的块根或圆柱状根供食用。紫山药富含薯蓣皂苷元，特别是它含有8种酚类黄酮物质的花色苷[1]。

花色苷是浆果和花朵中所看到的红色到蓝色的色素。人们对于花色苷在功能食品中的应用兴趣越来越浓，保健食品工业最近报道了花色苷的很多潜在的对健康的益处[2]，包括对冠心病，改善视觉和抗癌性，抗突变和抗炎症的效果[3-5]。

笔者采用体外试验的方法测定紫山药色素清除自由基的抗氧化性功能，为紫山药色素开辟了广阔的应用空间，为拓展紫山药色素的应用领域提供了理论依据，为天然抗氧化剂的开发人员和食品行业的技术人员提供新的参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

供试原料。新鲜紫山药，从市场上购买。

1.1.2

主要试剂。硫酸亚铁，水杨酸-乙醇，双氧水，抗坏血酸，PBS，Na2HPO4，KH2PO4，TCA，FeCl3，K3Fe（CN）6，DPPH，Tris-HCl，邻苯三酚，石油醚，无水乙醇，柠檬酸，浓盐酸，AB-8大孔吸附树脂。

1.1.3

主要仪器设备。

752PC型紫外可见分光光度计，SSW型微电脑电热恒温水槽，电热恒温鼓风干燥箱，予华牌循环水真空泵，台式离心机，电子天平，台式恒温振荡器，立式振荡培养箱。

1.2方法

1.2.1

紫山药的选取、购买。在紫山药成熟季节，选择品质较好、性状均一、无破损腐烂的新鲜紫山药。

1.2.2

紫山药的预处理。

将购买的紫山药洗净，去皮，切片，1%柠檬酸浸泡，烘干，粉碎，密封避光保存。

1.2.3

紫山药色素的制备。

称取一定样品用60%的乙醇溶液按1∶20 g/ml的比例混合均匀，调溶液pH至2，60 ℃浸提1 h，3 600 r/min离心15 min，将沉淀物按同样的条件重复浸提2次，离心，合并3次上清液，于50 ℃下旋转蒸发，浓缩。浓缩提取液于烘箱内干燥成浸膏状，冷藏备用。

1.2.4

紫山药色素粗提液的纯化。

1.2.4.1

预处理 。 将AB-8大孔树脂置于乙醇中浸泡24 h，充分溶胀后用蒸馏水充分洗涤，冲洗至无白色浑浊物出现后用5%盐酸浸泡8 h，用蒸馏水充分洗涤至中性，再用5%氢氧化钠溶液浸泡8 h，用蒸馏水充分洗涤至中性后备用。

1.2.4.2

大孔树脂对色素的吸附及解析。

分别称取1 g活化后的树脂置于三角瓶中，加入同体积的紫山药粗提液，25 ℃、110 r/min下振荡1 h至树脂吸附饱和。滤出水分，用pH为2、60%的乙醇，30 ℃、110 r/min下振荡1 h，抽滤，合并解析液，50 ℃浓缩至黏稠状，干燥得深红色粉末备用。

1.2.5

紫山药色素对羟自由基清除能力的研究。

在0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/ml待测物（粗提物样品及纯化物）1 ml中，分别加入9 mmol/L FeSO4 1 ml、9 mmol/L的水杨酸-乙醇1 ml、再加入8.8 mmol/L的 H2O2 1 ml，放入37 ℃水浴中反应0.5 h。以双蒸水作为参比，空白对照组以蒸馏水代替样品，对照组以抗坏血酸代替样品，分别做3次平行试验。在510 nm处测定吸光度，取其平均值，按下列公式计算清除率[6]：

羟基自由基的清除率（%）=（A0-A1）/A0×100

式中，A0为空白的平均吸光度；A1为样品的平均吸光度。

1.2.6

紫山药色素对超氧阴离子自由基清除能力的研究。

取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液4.5 ml，置于25 ℃水浴中预热20 min，分别加入1 ml 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/ml待测物（粗提物样品及纯化物）和 0.5 ml 25 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，再加入8 mol/L HCl溶液1 ml终止反应。以Tris-HCl缓冲溶液作为参比，空白对照组以蒸馏水代替样品，以抗坏血酸为对照，3次重复。在425 nm处测定吸光度，取其平均值，按下式计算清除率[6]：

超氧阴离子自由基清除率（%）=（A0-A1）/A0×100

式中，A0为空白的平均吸光度；A1为样品的平均吸光度。

在其他条件都不变的情况下将纯化物也同样进行超氧阴离子自由基清除能力的测定。

1.2.7

DPPH·清除能力的测定。

准确称取DPPH·20 mg，用95%乙醇溶解并定容于500 ml容量瓶中，则DPPH·试剂的质量浓度为0.04 mg/ml，避光保存。在0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/ml待测物（粗提物样品及纯化物）2 ml中加入2 ml DPPH·溶液充分混合。空白对照组以95%乙醇代替样品，对照组以不同浓度抗坏血酸代替样品，分别做3次平行试验。30 min后在517 nm测定其吸光度[7]。各待测物对DPPH·的清除率K可用下式计算：

K=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100

式中，Ai为2 ml DPPH溶液+2 ml待测溶液吸光度；Aj为2 ml待测溶液+2 ml溶剂的吸光度；A0为2 ml DPPH溶液+2 ml溶剂的吸光度。

1.2.8

还原力的测定。

普鲁士兰法测定还原力[8]：分别取0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mg/ml的待测物（粗提物样品及纯化物）2.5 ml和0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mg/ml的VC溶液2.5 ml，依次加入2.5 ml 0.5 mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH=6.6）和2.5 ml 1%六氰合铁酸钾溶液[K3Fe（CN）6]，于50 ℃水浴20 min，后快速冷却，再加入2.5 ml 10%三氯乙酸溶液（TCA），以3 000 r/min的转速离心10 min，取上清液2.5 ml，依次加入2.5 ml蒸馏水，0.5 ml 0.1%三氯化铁溶液，充分混匀，静置10 min后，在700 nm下测定其吸光度值，以蒸馏水作参比溶液。

2 结果与分析

2.1紫山药色素粗提物、纯化物对羟自由基的清除能力分析

该研究采用水杨酸法测定紫山药色素粗提物以及纯化物对羟自由基的清除作用。不同浓度紫山药色素粗提物及纯化物对羟自由基的清除作用见图1。

图1紫山药色素粗提物、纯化物对羟自由基的清除作用

由图1可见，紫山药色素纯化物、粗提物对羟自由基的清除率随其浓度的增加而增大，且具有明显的量效关系。紫山药色素粗提物和纯化物浓度较低时，对羟自由基的清除作用较弱，当浓度达到0.5 mg/ml时其清除率升高，粗提物为46%，纯化物为53%，VC为56%。进一步比较纯化物与VC溶液的IC50表明：紫山药纯化物清除羟自由基的IC50略低于VC，当纯化物浓度高于0.7 mg/ml时，其清除率高于VC。

2.2紫山药色素粗提物和纯化物对超氧阴离子自由基的清除能力分析

不同浓度紫山药色素粗提物以及纯化物、VC溶液对超氧阴离子自由基的清除作用见图2。由图2可见，紫山药色素纯化物、粗提物、VC溶液对超氧阴离子自由基的清除率随其浓度的增加而增大，且具有明显的量效关系。当浓度较低时，对超氧阴离子自由基的清除作用较弱；当浓度达到0.5 mg/ml时其清除率升高，粗提物为50%，纯化物为48%；当浓度为1.0 mg/ml时，纯化物的清除率（75%）高于粗提物（70%）；浓度达到5.0 mg/ml时，纯化物的对超氧阴离子自由基的清除率为95%高于VC（92%）。

图2紫山药色素粗提物、纯化物对超氧自由基的清除作用

2.3紫山药色素粗提物和纯化物对DPPH·清除能力分析

浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/ml的紫山药色素粗提物及纯化物溶液对DPPH·的清除作用结果见图3。由图3可见，紫山药色素对DPPH·具有较好的清除作用，纯化物的清除率高于粗提物，当纯化物浓度高于2.0 mg/ml时，纯化物的清除率与VC相当。

2.4紫山药色素粗提物和纯化物还原力能力分析

图4的结果表明，紫山药粗提取物、纯化物的还原力随浓度的增大而增大，二者呈较好的量效关系且存在显著的线性关系。纯化物的吸光度大于粗提物的吸光度，其还原能力大于粗提物的还原力，在浓度大于0.5 mg/ml时，纯化物的还原力高于VC，并随着浓度增加而增大。

图3紫山药色素粗提物、纯化物对DPPH·的清除作用

图4紫山药色素粗提物、纯化物还原能力

3 结论

紫山药色素对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH·都

有较好的清除效果，并具有一定的还原力。粗提物经纯化后抗氧化效果显著提高，纯化后清除羟自由基的IC50略低于VC，当纯化物浓度高于0.7 mg/ml时，其清除率高于VC。当纯化物浓度达

到5.0 mg/ml时，对超氧阴离子自由基的清除率为95%，高于VC（92%）；浓度高于2.0 mg/ml时，对DPPH·的清除率与VC相当。

参考文献

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